[求救] Southern blot 詭異的背景

[mitosi (mitosi)]

最近剛開始接觸southern blot, 用的是thermoscientific的kit, biotin labeled probe,

但在最後都會發現membrane上有一半的background就是深色的，而且不管怎麼hybridize,

怎麼blocking，那個背景值只存在於整張membrane的1/2(即上部分，well 那裡開始)。

如圖http://imgur.com/DOOEU5h

我很好奇到底是什麼原因造成partially background的產生

是因為transfer的時候所導致，還是?

感謝各位有經驗的大家分享寶貴的意見~~

不然我就沒有辦法繼續troubleshoot了!



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◆ From: 137.132.228.5
※ 編輯: mitosi          來自: 137.132.228.5        (10/25 11:24)
→ chl20020933:I建議you寫Chinese就好好寫  片子明顯是呈色問題
→ cutebetty:可能是membrane的問題
→ mitosi:chl大謝謝你的寶貴意見 不過由於都是學術專有名詞所以我還
→ mitosi:是傾向於用英文注寫 怕翻譯不好 所以請您多多包涵
→ puec2:我是不知道為什麼會分兩半，但一般來說是因為你沒有把ECL
→ puec2:滴乾淨就包起來去壓片，然後你的ECL可能很Sensitive，一些被
→ puec2:洗下來游離的二抗就在你包起來的區域裡面游來游去。
→ puec2:建議是把ECL滴乾淨一點。訊號有就是有，沒有就是沒有，不差
→ puec2:那幾分鐘。
→ puec2:但是我們以前用DIG壓出來的band其實都肥肥的，你可以考慮
→ puec2:增加DNA loading的量，讓訊號增強，就可以減少壓片時間，
→ puec2:還有你的DNA是不是很髒 還一堆卡在well上下不來？
→ mitosi:因為那個是total DNA所以會卡在上面，而且我的protocol裡沒
→ mitosi:有說明要把peroxidase洗掉 所以呈色的時候就沒洗
推 puec2:我跑total DNA 還是從植物組織抽的 也不會卡啊...
→ puec2:可以試試看先純化出細胞核再抽DNA 多一天而已