[求救] Cloning 反接

[Rarelay ()]

Hi, 大家好,

我遇到了一個 cloning 問題。

我現在正在做 GST-fused protein。



Insert 的部分，

首先我利用 SOEing PCR 的方式將 GST 和要表現的基因連接在一起後，

利用 HindIII 反應其中一端，

並利用 T4 DNA polynucleotide kinase (PNK) 反應另一端加上 phosphate group。

得到一具有一端為 sticky end (HindIII) 和一端為 Blunt end 的產物。



另外，我將載體以 StuI (blunt end) 和 HindIII 反應後，

以 CIP 去掉端點的 phosphate group。



接著，我將 vector 和 insert 以 10 fmole 和 30 fmole 的量混在一起，

以 Ligase 連接，並轉入 TOP10 中。



現在我遇到的問題就是，我所有的 clone 都是反接的。

用 colony PCR 的方式確認過百個 clone，

只要用 vector 兩端的 primer 均可找到目標大小的片段，

但用 gene primer + vector primer （有方向性的）就沒有 PCR 產物。

然後我隨機挑了 12 個 colonies 抽取質體，以 vector 上的序列引子定序，

序列是正確的，但所有 insert 都是反接的。




請問有人遇過這個問題嗎？如果可以請告訴我怎麼解決的。

還是有人知道可能發生的原因？

感激不盡～

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.79.42
→ lask:步驟看起來都沒錯 要不要先從簡單的PRIMER查起
→ lask:先看看當初設計的PRIMER是不是設計反了 5 3端顛倒之類的
primer 是確定沒有錯方向的。這部分也已經檢查過了。

推 milkpa:基因產物有毒，正接的basal有機會讓菌不長，建議換site
這我也認為是有可能的。

事實上我 His-tag fuse 相同基因是可以表現的。

但我用 his-tag 驅動的蛋白質表現量相當大，沒有變成 inclusion body,

加入誘導劑 IPTG 後生長也沒有明顯減慢。

這兩種表現只有 tag 不同。我也切相同的切位。

→ micocat:抽出來的DNA HindIII切得動嗎
訂序有 HindIII 的切位沒錯，但 HindIII: AAGCTT, StuI: AGGCCT，

看起來就算反接可能也能切開。

→ ralph31567:treat klenow 硬塞進去再來挑正反接如何?
其實這件事情我做過了。兩頭 blunt end 連接（全部接再 StuI）還是同向的。

→ xxtomnyxx:我第一個想到的是 vector MCS 上是 StuI→HindIII...
→ xxtomnyxx:如果是我我會想看看定序出來的序列、vector 和 insert的
→ xxtomnyxx:序列，也許能看出什麼端倪？
→ turtle24:如果insert先處理PNK 再切HindIII會有差別嗎
不知道差別會在哪邊。

→ micocat:HindIII跟StuI是接不起來的 insert的Hd3在末端嗎
→ micocat:有多幾個base嗎？
沒有多 base。就是 MCS-HindIII-gene insert-半個 StuI-HindIII 5 個 base

→ puec2:給vector, map, primer 大家幫你看一看？
※ 編輯: Rarelay         來自: 140.112.218.76       (11/07 21:43)
→ micocat:所以insert的Hd3是在末端沒有加base？這樣的話切不動哦
→ micocat:會不會vector跟insert的Hd3都沒切動 變成blunt end lig ?
→ blence:我也覺得是vector MCS看反了,應該是StuI在前,HindIII在後
→ blence:你先前發篇徵人啟事,該lab其中一篇碩論用的就是Ecoli syste
→ blence:跟你一樣用fusion gene,也是His-tag的pQE vector
→ blence:該vector就是StuI-HindIII的順序(話說StuI在MCS不是很頻繁)