[求救]stable cell line

[Marrisay (可愛的Comomo)]

各位大大好
我最近在建立stable cell line (使用HEK293)
transfect plasmid into cells後24hr
我換fresh的medium後(第二天)
隔天繼續讓cells長多一點(第三天)
在這幾個步驟間我都有觀察發螢光cells的比例
第二天及第三天比例都有在70%
但第四天準備要加G418篩選前
發現螢光cells的比例卻降低至20%左右
不知為什麼會這樣?
還是這是正常現象?
請各位大大能幫忙解惑
謝謝大家!

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◆ From: 58.114.221.18
※ 編輯: Marrisay        來自: 58.114.221.18        (11/14 00:56)
→ williamyang:是transient transfection?時間過就會開始下降
推 HEK293:episome
推 tsubasawolfy:就一樓說的...去蕪存菁
→ xxtomnyxx:剩下會亮的 20% 不是一開始吃了特別多 plasmid，就是已
→ xxtomnyxx:經嵌入 genomic DNA 變成 stable clone 了。
→ xxtomnyxx:順帶一提，我連用帶有SV40 ori的plasmid轉到293T中，經
→ xxtomnyxx:過6天也只剩下10%不到......
→ puec2:不錯的資訊
推 yanziyeh:可以試試看用infection建立stable clone
→ puec2:沒差吧 反正都要用挑的
→ xxtomnyxx:我給個方向吧：Scaffold/Matrix Attachment region
→ xxtomnyxx:等我回到研究所之後我打算用這個做做看，這是用episome
→ xxtomnyxx:建立stable clone的方法，但是現在用這個技術的研究還不
→ xxtomnyxx:普及。
推 HEK293:S/MAR其實一陣子了喔...至少聽聞Stanford已經做很開心去了
→ xxtomnyxx:1990 就有啦～ 但是我沒有看到很多用S/MAR做長時間over
→ xxtomnyxx:expression或knock-down的paper。
→ puec2:現在最紅的是TALEN
→ HEK293:之前不是還有transposon，睡美人或piggyBac之類的也行
→ xxtomnyxx:但是那些都會插到genomic，有可能會改變genomic的表現
→ puec2:那就多挑幾個啊... transgenic plant還不是一樣...
→ puec2:TALEN的優勢是你可以決定要插哪裡呦
→ puec2:理論上是不會亂插 >///<
→ xxtomnyxx:怕就是怕在好死不死選到有功能的區域......很多序列到底
→ xxtomnyxx:有什麼功能其實也都還未知，就算序列真的沒功能，也可
→ xxtomnyxx:能改變DNA長度讓某些regulation elements異常，所以我才
→ xxtomnyxx:比較喜歡episome  (ˊ _>ˋ)
→ puec2:用TALEN你可以直接插在你要改變的基因上阿...
推 aceliang:那來個AAV如何?