[求救] pcr產物長度有問題

[bbiioo (meimei)]

實驗內容:

將細胞養在dish，加入不同藥物濃度，作用後

抽取total RNA

進行RT-PCR，得到cDNA

再進行PCR擴增我要的片段


我預設跑膠後的結果

會是 不同藥物濃度處理後的細胞所得到的片段

應該會是大小一樣 濃度會不同

但實際跑出來的結果

是片段大小會有差距 而且是比原先預設的片段大小還大

為什麼會有這樣的結果?

是引子設計有問題嗎?

還是cDNA有問題?

不知道有沒有人有經驗作過的 幫幫忙解個答

謝謝哩

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.26.145.230
推 Bows:會不會是你的藥物影響到你RNA的splicing?
→ xxtomnyxx:首先想到的可能性同樓上，去查包含有intron的mRNA長度
→ xxtomnyxx:跟你的產物比對一下？
→ bbiioo:請問你們意思是說 alternation splicing嗎?
→ puec2:發了發了 但是堵10000 p幣你老闆不敢繼續做下去
→ qiet:賺到惹~~~定序看看~?
→ saviora:再重複幾次吧 如果是那可能就是在splicing上的影響
→ saviora:不過有做positive control嗎
  加藥濃度是從0往上增加這樣 所以~是跟無加藥處理的DNA比較，位置不一樣
推 caesar0926:把primer丟到 primaer-blast 看會有那些產物試試
→ caesar0926:                 primer
  我會去比對看看!
→ caesar0926:看不懂兩個意思 得到cDNA library? 和mager band??
推 caesar0926:或是 抽RNA時沒處理 讓genomic DNA 殘留
※ 編輯: bbiioo          來自: 111.252.239.8        (11/18 09:32)
→ bbiioo:打錯了是major band
→ bbiioo:genomic DNA可能有殘留 但引子設計有跨exon了..
※ 編輯: bbiioo          來自: 111.252.239.8        (11/18 09:39)
→ blence:請考慮產品長度,跨的intron長度說一下比較好討論,有些intro
→ blence:才100~200bp,不是有跨就沒問題
→ blence:另外是你做了幾次,換cell line? 定序了沒?
→ bbiioo:恩 因為是不同cell line不同基因都有這現象
→ bbiioo:我會再比對看看