[求救] 關於測collagen含量

[haaaaaa (work hard work smart)]

最近用6cm dish養fibroblasts並打算抽取其上清及ECM中的collagen，不過遇到了困難，想在這裡請教各位前輩，有沒有什麼特別需要留意的地方…以下是我follow一篇paper中方法：以0.05M acetic acid將細胞刮下，並加入10mg/ML pepsin，4度反應隔夜，接著使用10000 rpm離心10分鐘，取上清，並加入3倍體積之neutralization solution (200mM Tris,150mM NaCl)，最後將處理好的sample以USCN collagen type I ELISA kit進行測試。
可是一直測不到～陸續査了許多不同protocol ，有些提到要再用pancreatic Elastase處理並用硫酸銨沈澱。
也看過其他kit，前處理sample的方法大致與上述雷同。（當初是因為懶惰，看到USCN沒有標明任何需要sample前處理的步驟，覺得好像很方便就買了…）
希望版上各位前輩能撥冗傳授我一些該注意的事項～謝謝！！

By 好想測到collagen的人

P.s.手機排版有點失控，辛苦各位了～感謝耐心看完～


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 42.70.62.200
推 dddd77915:我也正在測，但還在想要用哪個方法。如果是買ELISA是否
→ dddd77915:有標準protocol 可以參照?你用哪家哪個貨號的?
→ haaaaaa:我目前是用MDbioproduct的kit(M036007)，我follow它的
→ haaaaaa:protocol抽出collagen，測定時順便測前處理有用到的
→ haaaaaa:solution(acetic acid和TBS)結果前者有matrix effect~
→ haaaaaa:我覺得很怪~不知道有沒有人用這個kit成功測得過耶~感謝!!