[求救] pro 5-alpha 的 Competent cell 製作

[cool155113 (Boy)]

發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題

若是求救事項涉及實驗室智慧財產(例如細胞細菌植株、質體載體等）之分讓，
請務必註明貴實驗室願意設立 正式合作或 簽署材料分讓協議(MTA)，否則版工將逕行刪除

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目前我做Competent cell
菌種是pro 5-alpha

做法是Rubidium Chloride method：
前一天先將菌養在10 ml O/N
隔天1/100加入培養
當A600到達 0.5 冰浴15min左右
用0.4被體積的Tfb I 沖洗，放冰上15 min 左右
再用1/100的 Tfb II 洗 ，放冰上 15min 左右
最後分裝 50 ul，迅速放入液態氮
最後裝盒放 -80度保存

隔天測效率：
分別用濃度 100pg / ul
1 ng / ul
10 ng / ul
的DNA，加入 5ul
冰上靜置30 min，42度heat shock 1 分鐘
迅速放冰上等5分鐘
將細菌放入 1 ml 的LB，培養一小時
取 100 ul 圖盤

結果效率卻只有 5 * 10 ^5
效率頗低。。。

想請問有人做過該菌種嗎？
還是有認為哪一步錯了呢？
謝謝 Orz

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 163.25.93.195
→ cool155113:對了，5*10^5 效率  是在濃度 10 ng / ul 的DNA中算到
→ cool155113:100 pg / ul ， 1 nl / ul的菌落很少，大約5～10顆
→ cool155113:這是為什麼？？  謝謝
推 Ianthegood:我覺得以chemical來說這濃度ok了阿
→ cool155113:OK嗎？  老師一直說一般來說效率為1*10^7以上
→ cool155113:可是老師也不知道哪個步驟該改進。。。一直無限循環
→ Ianthegood:efficiency的單位是cfu/ug 換算一下
→ Ianthegood:我的話前兩部冰浴會再久一點
→ cool155113:efficiency的算法是，數到的菌落/DNA濃度*加入ul量
→ cool155113:舉例來說：10ng/ul，有1000顆
→ cool155113:就是  1000/ 10 * 5 =  20 clone / ng
→ cool155113:然後換算成  clone/ ug  =  20000 clone/ ug
→ cool155113:最後因養在1000ul 只取 100ul 塗盤，所以在 * 10
→ cool155113:所以獲得  2 * 10^5 clone / ug  的轉質效率
→ cool155113:有算錯嗎？  對了，其實有試過前兩個步驟放久一點
→ cool155113:可是效果還是一樣  Orz
推 icome:re-suspension多次一點效果更好 O.D.0.3左右效率就很高
→ icome:0.5有點危險 過了0.5效率會陡降
→ cool155113:想問一下，因為網路上的流程都是Tfb II加0.04倍的體積
→ cool155113:但我們都是加0.01倍的體積，不知道這樣回不會有影響