[求救] PCR P不出來

[ai760721 (蜜汁排骨飯)]

各位大大好

事情是這樣的

我從FFPE的sample中抽取出了gDNA

要從裡面去P某段可能有mutation的地方

位子是在某個基因的Promoter靠近ATG的地方約100多bp

但是陸陸續續P了一個多月 始終都是P不出來

試過以下方法

增加DNA的量、Dilute DNA、通PCR inhibitor colume、增加primer量、增加cycle數、降
低annealing temperature、加DMSO、換Hot start的Taq、換過五組primer、做nested
PCR

通通沒用

DNA有跑過電泳 亮帶大約是在400左右

也有P過其他基因 是可以P出來的

唯獨我要P的這個地方怎麼P都P不出來

請問各位前輩 還有什麼方法可以調整的嗎??


--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.125.33
推 bluesnow1122:目標片段是多長?P不出來是沒有band嗎?P出來後是要定
→ bluesnow1122:序嗎? 你換primer是換怎樣的?只是附近的位置換幾個?
→ bluesnow1122:要不要試試P更長一點 有P出來的話在純化P小片段
→ ai760721:目標片段 從100出頭到接近300都有
→ ai760721:是完全沒有Band沒錯的 要定序
→ blence:"DNA有跑過電泳 亮帶大約是在400左右"  這句話完全看不懂
→ ai760721:因為FFPE的DNA本身就很片段 您覺得長一點可以長到多少?
→ ai760721:就是FFPE的DNA基本上跑電泳就是一片smear
→ ai760721:比較亮的地方大概是在400bp左右
→ blence:我會想去其他lab要個cell line的gDNA,試好條件再用FFPE
→ ai760721:可是我有用其他FFPE不同case的DNA P過這東西
→ ai760721:是可以P出來的
推 sunnyforever:可以簡述抽FFPE的方法和使用的buffer嗎
推 qiet:說不定真的就那麼幸運那段有deletion阿~
推 jabari:P不出來的deletion可多了..我有一段搞一年還沒搞定 囧
→ jabari:而且還作了MiSeq =.,= low coverage還是定不了breakpoint
→ blence:看本文會覺得是FFPE不能P出來,推文又說可以,文章沒說明是單
→ blence:一或所有case,如果只有各別某個,你的本文就明顯誤導了
阿  造成誤解真抱歉~ ~   其實應該是某種cancer的部分case P我要的東西P不出來
但是其他cancer的case或normal tissue是可以P出來的 另外我也有跟老闆討論過deletion
的問題  但是他覺得block裡面其實還是有一些normal tissue 應該不會全部都deletion
再加上文獻都只有提到point mutation的部分 在我的目標序列裡面還沒有看到deletion的
案例 當然也是不能完全排除deletion的可能 所以我其實只是想問問看 還有哪些地方
是可以調整 感謝各位大大
※ 編輯: ai760721        來自: 140.112.125.33       (11/29 09:09)