[求救] western blot 做膠

[xhunterx (藍雨飄楓)]

小弟最近要跑分子量 170kDa的蛋白

做膠時網路查到是用7.5% 但是實際操作後 發現gel很難凝固..

想請問一下有人有做過那麼大分子量的Western嗎?

可以建議配膠濃度可以給小弟嗎?

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 120.126.53.153
推 huangsw:不凝固先從APS TEMED開始抓問題吧
推 JFhorner:是用29:1的acrylamide嗎? 常用的37.5:1配低濃度比較難凝!
→ blence:"常用的37.5:1"....明明這個比例就沒什麼人用
推 marvelous13:不會啊…周遭的人都用37.5：1
→ martyrtitan:29和37.5都很常用..我想是APS放太久了 或者膠冰太久
→ martyrtitan:Acrylamide+buffer配好冰太久會凝得很差
推 icome:應該不會有這種問題 可能天氣冷凝比較慢?
→ blence:我的160kd是用8%就好,7.5%是給250kd用的,不過你應該放配方
推 JFhorner:blence好兇>< 我們平常都用37.5, 29是之前有人做4%native
→ JFhorner:gel凝不起來才買來用的@@
謝謝各位!! ^^ 最後發現是APS問題
※ 編輯: xhunterx        來自: 120.126.53.153       (12/16 22:00)
→ roy047:APS最容易壞 建議一段時間就重配一次
推 Evilnfs:APS每次新鮮現配最好 不會花太多時間的
推 wing00123:現配的最好
推 leoblack:APS配好後分裝凍-20保存,使用中的就放4度
→ joseph103331:180用10%都馬可以跑....
→ htLiu:配到6%都會凝,只是會很軟,TRENSFER要非常小心破掉
推 mayjasty:之前有遇過沒加Bis