[求救] Real-time PCR NTC訊號時有時無

[churchfire (別小看我...)]

小弟使用Roter gene 6000的real-time PCR machine.

Master-Mix為Bioline NO-ROX SYBR-Green

Total Reaction volum為20ul

檢體為plant Genomic DNA

問題是:我時常NTC(no-template control, 我用滅菌的無菌水)會有singal
Ct值直逼20-35左右~~~

我的primer量也下很少，各約100nM
至於是否有primer dimer，我是使用網路上的軟體設計的，我想應該沒有dimer的情形

我也將product去跑電泳切膠，amplicaon size 大約100bp，
這個確定就不是primer dimer了!!

我也加上melting curve，產物專一性很高，和我其他有加template的相當

有時會有出現，一般第一次打開的無菌水(或是廠商的水)都不會有singal
但第二次用的時候就有了，或是到第三次出現!@@

也分裝處理(一次用完就把那罐水丟掉)，竟然也是如此!!

請問大家有遇過這樣的狀況嗎??

PS:我們實驗室是電泳、Bench、machine都擺在同一大間實驗室的那種!!
會不會是air contamination?

感謝!!

發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題

若是求救事項涉及實驗室智慧財產(例如細胞細菌植株、質體載體等）之分讓，
請務必註明貴實驗室願意設立 正式合作或 簽署材料分讓協議(MTA)，否則版工將逕行刪除

           ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章----



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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 210.69.175.253
→ puec2:pipetman 污染 送去給人清吧
→ churchfire:才剛清回來!!
→ churchfire:有做同一時間用不同的水進行實驗!!有些水有，有些無!
→ puec2:那就可能是你的reagent已經污染到genomic DNA了
→ puec2:reagent換新的 primer重新dilute或重訂 改用filter tip
→ roy047:buffer dNTP 內是否有汙染?
推 chaunen:sample是human的嗎? 是的話操作要小心....
推 huangsw:NTC positive的melting curve溫度跟產物的是否相同？
→ churchfire:是的，melting curve溫度都是差一點點1-2度!!但都是同
→ churchfire:一支peak的感覺!!
→ huangsw:如果是這樣, 那你真的要小心了, 用下一篇大大的方式抓蟲