[求救] 小片段蛋白表現

[XD7103 ()]

大家好~

小妹在實驗上遇到一點困難，想請問一下大家><

目前因為實驗上的需求想純化小片段的蛋白

首先將蛋白依domain切成四個部分construct到pET-22b(+) Vector

定序結果都ok

但是利用BL21-CodonPlus Competent Cell表現的結果

只有一段可以表現在上清液，其他三段則是都不表現

目前試過的條件有25度及37度

IPTG的濃度試過0.5mM及1mM

由於是第一次純化，也不是很確定可以再修改那些條件

想請問大家是否有其他的建議

感激不盡!!!

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◆ From: 140.112.121.239
→ blence:這樣猜是有點蠢...是只有前面第一段會表現,後三段都不表現?
→ XD7103:不是耶 是只有第二段表現@@
→ Ianthegood:所以是4個construct四組菌的意思?
推 huangsw:先從whole cel lysate看看有沒有你要的分子量
→ huangsw:另外要不要找找inclution body的可能性？
→ XD7103:I大~ 沒錯!是有四組菌~~~
→ XD7103:H大~有壓片看過tag，分子量接近的地方都沒有band ><
→ milkpa:挑其他clone試試看
→ kshsdeck:真的表現不出來的話 只能換vector 試試pET系列的tags
→ storm780121:可以試試抓不同表現時間看看
推 kg9101266:請問induction時間以及分子量?
推 CACALALA:我建議妳換換vector@@
→ XD7103:分子量大約20KD左右，induction時間有試過4小時及18小時
→ XD7103:C大~請問一下這個vector不好用嗎？因為有一段ok所以也沒想
→ XD7103:過vector可能有問題XD
→ Ianthegood:RNA有沒有表現?
推 abcm1042:換個vector或是溫度可以低到15度 IPTG 也可以試看看0.1~0
→ abcm1042:.3mM 或是你有試看看純化看看會不會有呢?
→ abcm1042:frame有沒有對?
→ XD7103:Frame是對的~我試了0.1mM IPTG等結果囉~感謝！！