[求救] HPLC分離後的胜肽，合成回來後RT改變

[hsuan7919 (阿頭)]

小弟最近以HPLC將一個發酵產物分離出許多不同分子量的fraction

column:TSK G2000swxl (size exclusion chromatography)

mobile phase:KH2PO4 100 mM + 1M NaCl + 1mM EDTA

detector:UV

之後將這些fraction拿去以LC-MS/MS鑑定各根fraction中可能存在的序列

再分析各根fraction中哪段序列的可信分數為最高

將這段選定序列，送去外面生技公司做胜肽合成

合成回來的peptide我拿去再以同樣條件HPLC打一次

發現此peptide的RT，和我一開始以HPLC分離下來的fraction的RT不同(差很遠)

有想過是不是溶解度的問題

後來我也依照peptide性質以適合的有機溶劑溶解

但跑出來結果，和以水溶解沒有差別==


就分子篩column來說，就算某根fraction內可能的氨基酸序列有數條

那RT差一點點或許可以接受

但RT差有點多....我真的想不出是什麼原因造成的....

而且合成胜肽的peak的RT range也有點寬...不像是正常peak...


附圖在此https://www.dropbox.com/s/idn79zmeiuw6ro6/%E5%9C%96%E7%89%871.jpg


再麻煩各位有經驗的大大幫我解惑了!!!感恩~~


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◆ From: 119.15.236.32
推 huangsw:如果是peptide, 需要考慮是否有二級結構的問題
推 Peetu: 這隻column我用過，和成的peptide可能是不夠純
→ Peetu: 分析出來的peak才會有點寬，因為是平均分子量的關係
→ Peetu: 這支column主要也是依據分子量分析，樣品可以先跑看看SDS
→ Peetu: 就可以知道分子量正不正確了，不一樣的話當然peak會差很多
推 Peetu: 另外上機之前，建議將peptide變性後再去上機