[求救] Annexin V-FITC/PI跑流式細胞儀

[sss79818 (Sosad)]

不好意思 有幾個問題想請教一下各位大大
小弟最近在用流式細胞儀看細胞死亡途徑時遇到了一些問題
我的實驗是用光動力治療在細胞體內產生自由基來殺死Hela cell

實驗的設計是在照光後6 hr/24 hr收集起來
染完Annexin V-FITC/PI之後去跑flow來判斷細胞的死亡途徑
但是因為flow儀器預約時段的關係
我是把照光後6hr的細胞在染色完之後fix起來
保存到隔天把24hr的細胞染完之後再一起拿去跑

結果在用positive control(這組也是前一天染的)抓gate的時候發現
不管是單染FITC或是雙染的組別都看不到FITC的訊號
而單染PI與雙染的組別則都抓的到PI的訊號
這應該代表我positive control的作法沒有問題?
(kit裡的protocol是說把細胞泡在3.7% formaldehyde裡面冰浴30min)
如果protocol沒問題的話 只看的到PI 沒有FITC是很怪的一件事

我有問過實驗室學長 他是說FITC染完之後放到隔天太久 這樣訊號會變很弱
他建議先fix起來隔天要上機之前再染

這邊我有個問題
如果先fix的話 膜的結構會不會受到影響?
我們fix都是用3.7% formaldehyde固定20分鐘
而positive control也是用formaldehyde做 而且已經證實染的到PI
這樣不就代表膜已經受損到足以讓PI通過了嗎?
這樣先fix再染會不會讓普通的正常細胞也變成FITC+/PI+?
我們學長是說他沒染過apoptosis
他不知道這樣會不會有影響

如果會有影響的話
以各位的經驗FITC在染色完畢之後避光4度C保存大概能撐幾小時呢?

另外
細胞凋亡在啟動6小時後 應該仍是會處在早期膜外翻的狀態嗎?
我查過一些光動力治療相關的paper
有的抓照光後5小時後觀察 有的抓6小時後觀察
不曉得抓6小時這個時間點O不OK?

問題有點多 麻煩大家了

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.112.182.185
推 qiet:你的fixation buffer是用binding buffer稀釋嗎?
→ qiet:要是沒有Ca+ annexin V可能就掉了 自然就看不到螢光
→ qiet:FITC不會掉的那麼快, 放一兩天應該都測的到
→ grox:Fix完不就全掛了嗎...? 當時是收下來直接加Annexin V染
→ grox:我是用BD的
推 qiet:要先染好再固定就可以了
→ sss79818:感謝樓上二位 我想我找到原因了 我們LAB的fix buffer
→ sss79818:裡面並沒有Ca+
→ sss79818:如果我加點CaCl2把它配成裡面有Ca+2.5mM再fix應該就OK
→ sss79818:了吧? binding buffer裡的濃度也差不多是這樣