→ ai760721:我覺得純化完 10 ng/ul還滿正常的阿XD 03/13 14:55
→ ai760721:忘記問你是只切一刀 還是切一段下來? 03/13 14:56
→ blence:我覺得你什麼都沒寫,先猜你用100ul,結果就正常 03/13 14:57
→ blence:不過打這麼多字,卻沒有提到你PCR那部分是怎樣的正常 03/13 15:05
→ ayenyayaya:我用10ul回溶 只切一刀 03/13 17:23
→ ayenyayaya:PCR 產物純化後 用20ul回溶都還有0.2 ul/ug 03/13 17:26
→ ayenyayaya:主要是切過的plasmid yeild不到10% 感覺有點疑惑 03/13 17:28
→ ayenyayaya:我有試過一次切10ug的plasmid然後去純化 產量也無提升 03/13 17:29
→ micocat:為何只用10ul回溶？你有看說明書嗎 03/13 18:25
→ blence:如果這10ul是自己決定的,我想猜這實驗從切plasmid就不順利 03/13 18:56
→ ayenyayaya:10 是學長做過是可行的 所以照做 03/13 19:57
→ ayenyayaya:我試過照說明書用50也是一樣 03/13 19:58
→ aceliang:看不太懂是做gel extraction還是單純clean up 03/13 20:19
→ ayenyayaya:gel extraction 跟 clean up 結果都是相同的 03/13 20:45
→ KittyGod:你可以試試看加多點水50-100純化後再風乾 這樣應該可以 03/13 22:15
→ KittyGod:回收比較多 03/13 22:16
推 mesenchymal:可以把步驟六的產物 再回到步驟四做一遍,也就是 03/13 22:22
→ mesenchymal:elution 2次 03/13 22:22
推 milkpa:回溶的時候60-65℃加熱一兩分鐘 03/13 22:30
→ blence:有點好奇既然處理PCR的部分沒問題,又這plasmid換別kit也同 03/13 23:37
→ blence:樣狀況,怎麼會猜測是extraction kit的問題? 標題引導了答案 03/13 23:38
→ blence:而且如果已用了50,卻只先說10ul,只會引導出你已試過的方向 03/13 23:45
→ blence:另外文中的流程跟gel extract差一個W1步驟,這也是模糊的點 03/13 23:48
→ blence:總之現有的嘗試你應該試過不少了,你如何懷疑問題在這kit？ 03/13 23:51
→ xxtomnyxx:你有試過拿純化後的產物去跑膠嗎？load 個 5/10 ul 試試 03/14 09:12
→ ayenyayaya:我文中應該沒說我懷疑kit有問題QQ 03/14 09:23
→ ayenyayaya:是想問說有沒有其他可能可以改善的點 03/14 09:25
→ ayenyayaya:純化後的plasmid 我全load跑膠是啥都看不見 03/14 09:26
→ ayenyayaya:另外感謝上面的建議 我有試過可以提升一點點的產量 03/14 09:30
推 elelith:我有個問題... 為何binding和washing離心的轉速只有6000g? 03/14 10:21
推 bluesnow1122:我用一樣的kit 切完之後會先跑膠 切下之後再回收 03/14 22:03
→ bluesnow1122:離心都是用13000rpm 03/14 22:04
→ bluesnow1122:我的plasmid大小是4.5k 所以回收這個大小是沒問題的 03/14 22:08
→ bluesnow1122:純化後是測不太到 但是loading是有band的 03/14 22:09
推 conective:膠回收可能有問題 沒溶乾淨的話 純化前的量就少了 03/15 03:25
推 conective:膠回收可到70度, 回溶的水65-70度 03/15 03:29
→ ayenyayaya:感謝各位幫助 轉速是按照protocol所做 03/15 08:44
→ ayenyayaya:溶膠與回溶溫度問題有試過了 但無改善 03/15 08:47
→ ayenyayaya:目前我只能重複一直做 做到有成功ligation&transformat 03/15 08:49
→ ayenyayaya:ion 03/15 08:49
→ xxtomnyxx:加 DF 後加熱 60~65℃，每 1 分鐘 vortex 一次直到完全 03/15 14:07
→ xxtomnyxx:溶解，再 vortex 後 spindown，然後放到 4℃ 降溫後再過 03/15 14:08
→ xxtomnyxx:column。 這是我的做法，我之前發現如果融膠後的 DF 溫 03/15 14:10
→ xxtomnyxx:度太高，會讓 DNA 回收的產量減少。 03/15 14:10
→ blence:我說的kit問題是抽kit過程的問題,不是kit本身,你的標題寫著 03/15 17:39
→ blence:DNA extraction kit,內容又附kit流程,當然會引導這個方向 03/15 17:40
→ blence:既然你不覺得kit本身,抽的流程又與PCR一樣,何不探討plasmid 03/15 17:41
→ blence:切之前的濃度,切後的狀況,以及不切,等同濃度直接跑膠純化? 03/15 17:43
→ blence:或許你也可能都試過了就是(只是你文章也沒說試過這些) 03/15 17:47
→ blence:其實第一個推文就寫了,而且做cloning,10ng/ul已經很夠用 03/15 17:52
→ blence:比較覺得怪怪的地方反而是你的PCR竟然純化出4ug,大概只有特 03/15 17:53
→ blence:殊實驗才會這樣,這應該pool很多管吧,一般用途反而怪怪的 03/15 17:55
→ blence:而且你做clone,一般雙切只有10ul,很難避免star activity 03/15 17:57
→ blence:如果RE有千放少,也會擔心切不好;若只是單切,那追求高濃度反 03/15 17:57
→ blence:而造成之後self-ligate的現象增多(尤其你切完沒說有CIP) 03/15 17:58
→ blence:附帶一提,plasmid的4k都是假設切完前後一致,該不會差很多吧 03/15 18:03
推 chaunen:單切一定要做CIP(or AP) 挑過1k顆菌cPCR的路過 03/17 09:45
→ chaunen:老實說, 我切膠純化的回收率不知為啥總是很低25%-40% 03/17 09:47
→ chaunen:OD260/230 時常過高(<1) 初始low melting gel重<300mg 03/17 09:51
→ chaunen:最後wash也兩次 13k rpm 3mins後 還會65度C 乾3mins 03/17 09:52
推 chaunen:有時候水加下去會在膜表面形成水珠 吸不下去 有解嗎QQ? 03/17 09:57
→ blence:只憑回收率太低有太多可能;水無法吸收則是膜太乾了 03/18 00:59
→ satasumi:切膠用的gel先借別人家的不同牌的,看是不是純度不良 03/27 18:47