[求救] 切位是正確的但是切不下來

[bluesnow1122 (藍雪)]

我設計基因左右兩邊不同的切位(XbaI/KpnI)的primer(有多加4個mer)

PCR之後加A,ligation到pGEMt-easy

之後抽plasmid送定序,序列是對的,切位都在

切EcoRI OK

跑基因全長的PCR OK

跑M13F+M13R OK

唯獨切XbaI和KpnI切不下來...

XbaI和KpnI確定沒有問題

我用同樣的條件切另一個clone的基因是可以切下來的

我是先切XbaI 1HR 再切 KpnI-HF 30 mins (NEB)

想請問有沒有什麼問題是我沒有考慮到的? 謝謝~

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.117.93.237
※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1395890649.A.F0D.html
→ grox:methylation? CpG? 還是你要切久(O/N)看看?
→ soom:XbaI 是dam methylation sensitive
謝謝提點
我的切位序列是
5'         3'
GAT|CTAGACC
CTAGATC|TGG
3'         5'

網路上找到的資料是 XbaI前後有GATC就會受甲基化影響

請問甲基化的問題有辦法解決嗎?
或是換限制性切位會比較快? 謝謝
※ 編輯: bluesnow1122    來自: 140.117.93.237       (03/27 12:37)
推 soom:找dam-的菌株(ex. JM110) 或是設計別的切位都可
→ bluesnow1122:謝謝^^
→ roy047:樓上正解~ 沒dam就不會甲基化了 plasmid seq不受影響