※ [本文遭板工誤刪，在此向young1022板友致歉]

作者: young1022 (183) 看板: Biotech
標題: Fw: [實驗]glucose oxidase 相關問題
時間: Mon Apr 21 23:42:16 2014

※ [本文轉錄自 Chemistry 看板 #1JLJ7Deg ]

作者: young1022 (183) 看板: Chemistry
標題: [實驗]glucose oxidase 相關問題
時間: Mon Apr 21 22:57:15 2014

各位神人您好
在下是個研究生
最近欲使用glucose oxidase氧化葡萄糖產生H2O2
利用自己和成的納米纖維(具有peroxidase activity)將H2O2分解成自由基
使得氫氧自由基(OH dot)與顯色劑TMB反應而顯色

目前遇到的困難是
實驗不管怎麼做都無法顯色
相關實驗步驟如下:

Solution preparation:
1.Glucose oxidase – 取定量GOD粉體，直接溶於pH5的醋酸緩衝液(1 mg/ml)，直至變為
黃色均勻溶液後，直接放入冷凍庫(-18.5 o C)冷凍。
2.Glucose solution – 取定量glucose粉體，溶於DI water中，待完全溶解後直接放入
冷藏(~2 o C)
3. TMB stock solution – 取定量TMB粉體，溶解於DMSO，配置成20mM的stock solition
後，放入冷凍庫(-18.5 o C)冷凍。


Procedure:
1. 先將預先配置好的glucose oxidase solution於冰浴中退冰，然後將0.5ml磷酸鈉(pH
7)緩衝液及0.1ml葡萄糖溶液加入2ml體積的eppendorf中，待GOD退冰後，取0.1ml再加入
上述的eppendorf中。
2. 將eppendorf用隔水加熱方式，於37oC下加熱30min(在暗室下操作)。
3. 取3.8ml的醋酸緩衝液(pH 4)及1mg ZnFe2O4粉體，置於事先用鋁箔紙包裝好的樣品瓶
(~20ml的體積大小)內，隔水加熱37oC。
4. 待eppendorf內溶液反應時間到，直接加入於上述的樣品瓶內，同時再添加0.1ml的
TMB solution，然後反應計時30min。
5. 待反應時間完畢，將樣品瓶內溶液取定量體積出來離心沉澱後，取其上層液體，直接
做UV-Vis光譜儀光學量測，量測波長為653nm。


    所使用的GOD根據sigma所提供的物質資訊，其比活性為100,000U/g，而之前實驗中，我添
加0.1ml的GOD(1mg/ml)，經換算大約為10U。根據sigma定義的1U為:
在pH5.1的醋酸緩衝液，溫度為35度時，其每分鐘可氧化1μmole的葡萄糖。
    實驗中所添加的葡萄糖量為: 490mM(初始配好的溶液) x 0.1ml(所添加的量) = 49μ
mole
    雖然在本實驗反應條件為pH7且環境溫度為37度，並非pH5.1且35度，但大略計算其活性，
大概可消耗10U x 1μmole/U-min x 30 min = 300 μmole 葡萄糖，也就是相對可產生
300μmole的過氧化氫。

    由於實驗做不出來，因此我根據上面的理論計算，我直接跳過GOD氧化葡萄糖的過程，直
接添加配置好的H2O2溶液(490mM)。並且將實驗步驟稍微更改為:
1.取0.1ml，490mM過氧化氫溶液及0.6ml (0.5 + 0.1，多添加0.1乃是為了使反應濃度可
與之前實驗依樣，因此多添加了0.1ml，這樣可使整個反應體積為0.7ml )磷酸鈉緩衝溶液
於eppendorf中。隔水加熱30min於37度下。
2.接下來的實驗方式都一模一樣。

    結果利用此種方式可以得到相當明顯的顯色
根據上面的方式，我還做過49mM以及4.9mM的H2O2
最低濃度也是略有顯色

葡萄糖氧化酶才剛買沒多久，應該不會出問題
因此很困惑
最原先的實驗方式是否有哪裡出錯了呢?



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推 wanderchang:storage temp.   2-8°C           酵素被冰壞了嗎？
推 wanderchang:lyophilized protein powder很強壯，in solution未必
→ wanderchang:新鮮配置試試看
→ young1022:其實我今天有再試過,直接將GOD粉體溶於緩衝液體中
→ young1022:等待混和均勻後,直接使用,結果還是做不出來
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※ 轉錄者: young1022 (140.115.223.11), 04/21/2014 23:42:16
※ 編輯: soom (128.54.38.185), 04/22/2014 01:05:26