[求救] 第二代 Lenti packing system 質體純化

[silverberry (平行線上的交集....)]

最近新手上路 lentivirus transfection 做 iPS

接到的第一個任務是準備 packing 用的載體 psPAX2 和 pMD2.G
https://www.addgene.org/mammalianrnai/Packaging/
2nd generation system deposited by the Trono lab

實驗室的學妹之前純化這兩個載體，
是從 -80 glycerol cell stock (stbl3 strain) 養小量 0.5 mL 半天，
然後傍晚放大到 200 mL overnight 到隔天，
用 Qiagen 的 Hispeed midiprep 純化，
最後分別得到 ~25 和 100 ug 的載體。
遠遠不夠接下來的實驗需要。
(實驗室用的比例是 15 ug psPAX2 + 5 ug pMD2.G + 30 ug pLOVE-gene into 1 plate
 至少要 8 個 plate)

我懷疑是 glycerol cell stock 不行了，
所以新 transform 的 colony 養小量然後放大成 400 mL，
隔天把 400 mL 的 culture 分成兩部分，
其中的 5 mL 用 Qiagen 的 Miniprep 抽成 50 uL plasmid；
剩下的用 Hispeed midiprep 純化成 1 mL。
結果 5 mL 分別抽出 ~100 ug 和 ~37 ug 的 psPAX2 和 pMD2.G
但是 midi 只抽出   ~23.5 ug和 ~95 ug 的 psPAX2 和 pMD2.G (定量都是用 nanodrop)
Miniprep 的 column 理論上是 20 ug 的 binding capacity，
而 hispeed 是 200 ug。
不管怎麼算都很覺得有點奇怪。

三天後，我用新轉的 colony 重新養小量 30 mL，
用 miniprep 重抽一次 (分成 6 管)，
結果分別得到 ~20 ug 和 ~50 ug 的 psPAX2 和 pMD2.G


到這裡，實在卡關了，
Addgene 上面說這個載體是 high copy，
根據 QIAGEN 的說法，理論上會有 3-5 ug DNA/ml LB culture。
看看自己這幾次的操作，
只有新鮮 transform 的那天的 5 mL 抽出理想的量，
其他都遠低於理論產量。



請問版上的大家，
我該怎麼改善我的步驟才能得到合理量的載體?

先謝過大家 m(_ _)m


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→ grox:感覺是Midiprep kit/抽取問題...常抽這些plasmid也沒原po情況
→ roy047:該midi抽其他plasmid正常嗎？
→ silverberry:midi 抽 pLOVE 產量大約是 mini 的一半到七成
→ silverberry:除了這些載體以外，其他載體很少需要這麼多，
→ silverberry:所以也沒有比較的依據。
→ silverberry:可以請問 grox 大那個小飛碟 elute isopropanol 沉澱
→ silverberry:DNA, 有沒有什麼需要注意的技巧?
→ silverberry:不過 kit 也快用完了，看看換新的 kit 會不會有差!
→ silverberry:感謝^^
→ grox:加完三種buffer變蛋花湯後離心, 取上清液時個人習慣用濾紙過
→ grox:濾...不能讓渣渣掉到column內, 不然會塞住, elution時DNA變少
→ grox:Isopropanol加進去離之前要輕輕震盪破壞分層再離...離完應該
→ grox:看得到pellet, 小心不要lost....目前想到大概這些吧
→ grox:因為Midi相較於Mini容易有些小地方導致失敗, 所以要注意
→ silverberry:感謝 grox 大! 我會注意這些細節再試試看~ m(_  _)m
推 chaunen:應該不用stbl3吧? 可以用尼龍網篩濾渣(40 70 100um隨便)
推 chaunen:用完洗過 泡鹽酸1N 滅菌 可重複用
推 chaunen:我只有pLKO用stbl3 packing用的8.91 MD.G 都用一般
推 chaunen:3種buffer加完可以on ice shack 30mins ~100rpm
→ chaunen:渣渣最好變成蛋花湯 不是蛋包湯 lysis不完全產量低很多
→ chaunen:三種buffer加多一點 10ml>15ml for 1.5g pellet 濕重
推 chaunen:400ml菌液應該夠抽2個maxi了吧
→ chaunen:堤外,有沒有推薦的endo-free mini kit? 做transfection用
→ silverberry:感謝 c 大，pMD2.G 和 psPAX2 我們是用 DH5 alpha
→ silverberry:只有 LTR 的用 stbl3。
→ silverberry:我們 transfection 用的也是 qiagen 的，最近我剛要
→ silverberry:測試 Zymo 和 invitrogen。
→ silverberry:看看好不好用再跟大家分享