[求救] 抽取 E.coli 的染色體(DNA)

[shunminhsu (sharkhsu)]

小弟抽了幾次DNA，但出來的濃度(約35)和260/280(約1.35)都非常低，感覺都沒有順利抽出。

所以想請問各位前輩，還有什麼方式能改善產率呢!?


採用:Protech-Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit給的protocol

步驟如下:

1.將離心後的菌塊加入(20mM Tris-HCl, 2mM EDTA, 1%triton X-100,
  20mg/ml lyspzyme) 100μL

2.放置37度30-60 min      3.加入350μL Extraction Buffer

4.加入4μL proteinase K 溫和搖晃

5.放置56度1-3h           6.加入300μL DNA binding buffer

7.將溶液轉移至spin colimn和collection tube, 14000 rpm 離心1min
  丟棄下層液

8.加入700μL Wash Solution 離心丟棄下層液後再離心5 min

9.移去collection tube, 將spin column放置microcentrifuge

10.加入50-100 μL DI水 or TE, 離心1 min後保存


之前有試過用酒精洗一次就好，但效果還是不明顯..所以想請問各位前輩
還有什麼方法可以改善的嗎!? proteinase有必要再放更久嗎!?之前都放三小時..

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※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/01/2014 16:01:22
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/01/2014 16:02:32
→ Invec: E. coli加 proteinase K? 應該要加RNase吧 拿錯kit?
呃...所以不能用proteinase k嗎? 因為我是去其他實驗室借kit用的.. protocol上面確
實也寫菌是用proteinase k 冏
※ 編輯: shunminhsu (114.33.254.137), 09/01/2014 17:48:45
※ 編輯: shunminhsu (114.33.254.137), 09/01/2014 18:14:26
推 yours8527: 你知道用pk的目的嗎?
呃 ... 是知道 .. 但無法確定可不可行
※ 編輯: shunminhsu (114.33.254.137), 09/01/2014 20:57:50
推 licat: 在加PK前  溶液應該還是混濁的  PK作用完後會變澄清
→ licat: 就你觀察 有這樣嗎?
有這個現象沒錯.. 加完binding buffer後有再離心..瓶底的白色塊狀挑掉..
但總覺得我在用Wash Solution洗完，整個DNA都不見了..最後加完DI水，
感覺都沒有回溶到。
※ 編輯: shunminhsu (114.35.162.46), 09/02/2014 05:13:29
※ 編輯: shunminhsu (114.33.254.137), 09/02/2014 09:14:25
→ Ianthegood: column based就是產量不高 DNA進column離心前擺涼擺久
→ Ianthegood: 一點 elution bfr熱一點擺久一點 可以提高一點產量
→ Ianthegood: 如果真的需要大產量還是用傳統法吧
謝謝建議，但現在疑惑是染色體DNA抽出來濃度應該要很濃才對...但是我的既不純
又不濃，這應該不算正常吧!?
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/02/2014 10:19:53
推 licat: binding buffer 成份是? 原始protocol有說加入後要離心嗎？
DNA binding buffer - 20 mL (8M Guanidine HCl), protocol是說有些組織(這邊舉例班
馬魚、植物纖維)的碎片比較難digest, 所以藉由離心以後再把澄清液放到spin column.

财
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/02/2014 12:00:49
→ Ianthegood: 你的column就只能抓這麼多啊
呃..今天抽出來的值正常多了..但正常DNA要保存在-20還是4度C呢?滿多人都說-20,
但又有人說-20會產生冰晶..怕解凍完會影響濃度..
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/02/2014 12:31:38