[求救] PCR跑不出來!! 請各位前輩幫忙..

[shunminhsu (sharkhsu)]

既上次抽染色體的問題解決之後，現在又遇到PCR的問題。

之前抽出的E.coli K12 測nanodrop濃度約:350ng/μL

260/280:2.04 ； 260/230: 1.88


配方如下:

10x buffer:10μL   dNTP:10μL  primer(50μM):各1μL

KOD:2μL  MgSO4:6μL template:3μL  DI水:67μL



 PCR condition:

 95度C  120sec --->denature
 55~65度C  60sec---> annealing
 72度C  60 sec ---->extension
 30 cycle



配成100μL分成10管測溫度gradient，但每次跑膠完幾乎都沒東西。

和老師討論完的結果，可能是template的量太多。於是又改成1μL去跑，

但跑出來也是全部空的..所以想請問各位前輩問題可能出在哪裡!?

去查DNA template的使用濃度說法也都不同..

現在也滿擔心本身template或primer本身出問題..
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.123.126.146
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※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/11/2014 16:29:29
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/11/2014 16:40:47
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/11/2014 16:45:21
→ a90648: dNTP濃度多少?之前發生過有人忘記dilute所以跑不出來
dNTP:2mM
→ blence: 既然用了KOD，為什麼PCR condition不是照KOD的建議？
呃..實驗室學長也是用差不多的條件，所以就沒再調整了
→ ko363630: template濃度是um還是nm？
當時測出來的時候是350 ng/uL ..
※ 編輯: shunminhsu (114.35.165.133), 09/11/2014 22:18:11
※ 編輯: shunminhsu (114.33.254.137), 09/11/2014 22:21:02
推 leoblack: 建議你用KOD建議的條件做~太濃的template KOD反而沒產物
推 ko363630: 同樓上 原ＰＯ真的太濃了
→ Ianthegood: template用10%
→ Ianthegood: 然後為什麼不把條件列成濃度還要我們幫你算= =
因為我不太懂濃度的單位... 去參考每個人的都不同=  =
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 10:37:39
→ blence: 各種PCR條件的濃度單位幾乎都一樣,只有數值的不同
→ blence: 如果各家都不同,何不直接參照KOD就好,整篇都沒寫單位很扯
 不好意思，這部分我會再注意..
[1;31m→ supray: 單位要弄清楚呀...                                       09/12 11:49
 supray: amplicon多大呢?                                         09/12 12:33
要P的產物大概950bp，照理不難P才對 冏
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 13:41:50
推 leoblack: KOD建議plasmid的template濃度只要1ng就好~你下了多少？
→ leoblack: genomicDNA只要200ng就好
呃... 最後一次dna template是加1μL .. 溶液總量100μL
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 14:09:16
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 14:10:10
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 09/12/2014 14:17:03
推 ararthur: 只能建議盡量用"重量"或"濃度"去算 少用體積才不會失了
→ ararthur: 重點
→ supray: http://www.purigo.com.tw/UserFiles/file/KOD-201(1).pdf
→ supray: 是上面那組嗎?
→ supray: 說明都寫得很清楚 也有Troubleshooting呀
→ Ianthegood: 不管怎麼樣換成濃度都比體積好
→ freiburg: volume is nothing!!
推 a102242002: 我的經驗是這樣，使用多個濃度的DNA去做PCR,看哪個濃
→ a102242002: 度有做出來就使用那個濃度
→ satasumi: 1.建議重測濃度 2.起始denature溫度跟時間?