[討論] 同樣條件，PCR第二次卻P不出來!?

[shunminhsu (sharkhsu)]

小弟PCR前有做過gradient測試，有成功找出最佳溫度。

因此在P產物時，就以此溫度下去P。第一次有成功，但不

曉得為什麼，第二、三次就P不出來了..


儀器方面，溫度應該是沒問題。現在不曉得是不是因為temlpate

反覆凍融太多次，導致DNA(E.coli genomic DNA)都降解掉了..


template 濃度 : 0.84ng/μL (Taq 範圍是寫10pg-500ng)


濃度應該沒錯.. 只能請求各位前輩幫忙了..


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.123.126.146
※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1412387273.A.B98.html
→ Ianthegood: 你不覺得你給的條件有點模糊嗎...?
→ Ianthegood: pcr條件 sample怎麼萃的 儲存方式 凍融次數
sample是用kit抽的，平常和藥品(10X buffer,2mM dNTP, 50μM primer)  放在-20保
存。凍融的話，上星期大概開了3-4次..
PCR 條件: 95: 5min, 95: 1:00min, 55: 1min, 72: 10:00min  35cycle

※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 10/04/2014 12:50:24
推 huangsw: 我覺得你的cycle設計的怪怪的 72度10分鐘x35cycle?
→ lail: product很長吧，所以elongation時間長
→ RickyKckao: 如果是product很長 一般Taq撐不了那麼久吧!?
推 goaremdy: E.coli genomic DNA有這麼容易降解嗎@@
推 Invec: phusion 1K/15sec 這酵素哪家的要作到10分鐘 我絕不買
→ lail: genomic DNA應該是怕斷裂吧
推 ljii: gDNA保存在TE還是水? 如果是水可能freeze thaw數次後就不穩
→ ljii: 另外你product是多長啊? >10kb嗎? 你確定第一次p出來的是
→ ljii: 產物還是nonspecific band? 10kb用普通Taq去p應該很難
我是保存在水裡面，真的就怕回融數次後壞掉。 另外產物約為2kb，而72度設定10分鐘的話，
是照說明書下去設定的。現在感覺變數很多，不太敢亂調整..
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 10/06/2014 12:07:54
→ RickyKckao: 你的cycle會不會是95:1min 55:1min 72:1min ? 最後才
→ RickyKckao: 72:10 min做extension?
阿..少打一項! 確實是先72: 1.5min 再 72: 10min
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 10/06/2014 14:15:19
推 yaliu: 不覺得這樣凍融次數就會降解...不然你可以再萃一次看看
→ yaliu: 我也發生過第一次可以P出來，但之後怎麼試就是不行..或許
→ yaliu: 其實錯的是第一次....假設所有材料都確定OK，那就只好換
→ yaliu: primer了
呃..其實當時候有三瓶tempalte，第一瓶用了約4-5次後就P不出來。第二瓶大概2-3次，第三
瓶一次都P不出...
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 10/09/2014 10:26:10
→ xxtomnyxx: 之前實驗室有遇過類似的問題，以前都做得出來的 PCR 突
→ xxtomnyxx: 然就都做不出來了，除錯除很久後發現是 primer 的問題
→ xxtomnyxx: ，似乎是該 primer 序列很容易造成降解，重新設計後問
→ xxtomnyxx: 題就解決了。
序列機率感覺不大 .. 因為有兩組primer再P不同產物..但都P不出來 有點冏
※ 編輯: shunminhsu (140.123.126.146), 10/13/2014 15:33:44
→ satasumi: gradian PCR依原本的條件再跑一次,樣品放在P出來的位置