[討論] in vitro system與細胞實驗 藥物劑量差異

[waitingu (Phil-Ku)]

由於最近在補一個藥物實驗的data

看到in vitro kinase assay覺得滿好玩的

就來嘗試看看 結果卻令人有點無法解釋:

Compound A在kinase assay可以拉出正常的inhibitor log曲線 換算回去IC50為17 uM

但在細胞實驗中 只要2 uM的compound A

即可對此kinase p-Tyr level及其下游蛋白磷酸化有很顯著的抑制效果

(IP及WB已重複多次)



令我疑惑的是 通常都是細胞實驗或動物實驗的劑量

會大於IC50 of kinase activity劑量 (這還滿好解釋的 像是half-life等等)

但現在情況卻反過來 原廠是建議可以調整ATP濃度看看 能不能把log曲線往左右移動

(已經試過調整kinase量，對求得的IC50沒有顯著差異)



跑去問藥理跟藥學的同學 她們說還滿常碰到這種情形的

也只能把這個data收起來或再repeat看看



想請問一下各位專家們，碰到這種情況該怎麼解釋

或是有可以改變的條件讓兩種實驗的濃度不要差太多呢?

感謝！

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※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1415699416.A.3D7.html
→ yuasa: Kinase assay的原理是什麼呢?Sensitivity說不定比較差
→ yuasa: 也有可能是像原廠說的condition沒有抓得很好
我是用Progema的ADP-Glo system

簡易版步驟就是:

kinase + inhibitor + ATP反應

然後再加入ADP-Glo這個reagent去反應

最後加入reaction buffer去測冷光

所以可調整的變因大概都在第一個反應那邊
→ yuasa: 也有可能compound A不太專一，在細胞內有別的效果出現
→ EDaDaDaDaDa: 有沒有可能是進入細胞內compound A的量比出細胞的少
→ EDaDaDaDaDa: 導致胞內外濃度差，所以實際胞內濃度已經遠超過2uM
這解釋也是有可能 但又要想實驗證明(默

推 qiet: 未必是direct target 到那個kinase上, 也可能透過indirect
→ qiet: 作用, 如影響更上游 or 加強phoshatase功能等等
→ qiet: in vitro 做出來IC50是17uM應該沒有人會相信是真的on target
沒錯 這也是我覺得很恐怖的原因

推 Ianthegood: data永遠是對的(默)
→ blence: 其實整篇看不懂原廠指的是哪一個,compound? kinase? kit?
→ blence: 文中提到原廠建議調整ATP,你卻調整kinase,好像雞同鴨講
我第一次實驗先做了ATP conversion standard curve & 原廠建議的kinase量

發現偏高以後 將kinase量減半 其他條件相同 再做一次實驗 發現結果差不多

才致電原廠 並得到可以從ATP量下手的建議 XD
※ 編輯: waitingu (140.122.143.252), 11/12/2014 09:51:55