[求救] 用whole blood檢體跑flow

[vantis (凡提斯之貓)]

flow新手第一次在此發問

想請問各位前輩,若要分析neutrophil surface marker,

whole blood sample如果自採檢後,放置於冰箱冷藏兩天後才進行實驗

是否會嚴重影響到細胞活性?

最近因為上flow遇到細胞都變成debris的問題,完全無法分析~非常苦惱


作法:
     1.將antibody mix好

     2.加入100ul whole blood, 4℃ incubation 30 mins

     3.加入lysis buffer, RT incubation 12 mins

     4.1200rpm 4℃ 5 mins centrifugation, discard supernatant

     5.加入1 ml staining buffer wash

     6.1200rpm 4℃ 5 mins centrifugation, discard supernatant

     7.加入500ul staining buffer, suspension pellet

     8.上機

reagent都是BD commercial

最近做flow結果時好時壞,不是很穩定~真的很苦惱啊!

不知道有沒有什麼小罩門可以傳授

非常謝謝大家解惑喔!

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 111.243.240.232
※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1416227654.A.2EA.html
※ 編輯: vantis (111.243.240.232), 11/17/2014 20:39:35
推 jabari: 檢體新鮮 標完抗體 fix完再放冰箱  放兩天有點久??
推 qiet: 冰兩天一定爛光光阿，染完用2%PFA固定吧
→ saviora: 細胞不固定放這麼久當然破給你看
非常謝謝各位回答!
因為目前主要卡在檢體供應端的地方
也就是有時候我拿到檢體的時候已經放置兩天左右
老闆會覺得放一天還做得出來,放到兩天影響會這麼大嗎?
不過從推文看起來,看起影響真的不小!
所以...只好去跟老闆好好談談吧XD
※ 編輯: vantis (111.243.240.232), 11/18/2014 05:16:27
→ yuasa: Neutrophil幾個小時候就開始死了啦，況且你又沒做任何處理
推 theonedelete: 試過放一天，勉強可以，兩天就完全不行了
推 lesswind: cell放超過6小時就要固定了...不然就會壞掉了QAQ