Fw: [問題] 關於整個qPCR的trouble shooting

[baal90317 (夢夢夢夢想家)]

※ [本文轉錄自 Biology 看板 #1LLhJMb3 ]

作者: baal90317 (夢夢夢夢想家) 看板: Biology
標題: [問題] 關於整個qPCR的trouble shooting
時間: Sat May 16 11:09:08 2015


【問題】：從細胞中取RNA到轉成cDNA到最後跑qPCR可能出問題的步驟和確認方法


【問題起因】：1.qPCR出來的結果不太正常,要如何學習去找出問題的根源

              首先 取RNA時 要先確保RNA不會被降解  過程中的小細節不提

              取完之後到跑qPCR之間 有哪些方法可以知道自己取出來的RNA有沒有

              問題呢?

              2.用kit(invitrogen)取出的RNA 280/260的值很好(~2.0)

              可是260/230卻很糟 (~0.5)過程我也沒用有機溶劑

              用kit的可以用酒精洗嗎?



【個人看法】：取完之後先用nanodrop看 280/260 和 260/230的 O.D.值

              但是就算O.D.值沒有問題  RNA有可能斷成小片段而不知道

              導致最後qPCR的結果不好 (melting curve沒問題)

              因此中間可能要用跑膠的方法去確認RNA的完整性  但是我大學科系

              非生科背景 原理懵懵懂懂 不知道跑膠該設那些組別來跑

              跑cDNA和跑RNA各有那些優缺點也不知道 學長姊也都非生物背景

              大致上都不知道 (是生物背景的也沒做PCR)

              可以請各位給些建議看的書籍和一些建議嗎? 謝謝!!!



【參考資料/連結】：

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
※ 轉錄者: baal90317 (140.113.136.221), 05/16/2015 11:10:34
→ jabari: 啥?? 你的問題是??
推 jabari: 用kit260/230的問題 根本原因是你加wash buffer時沒有轉一
→ jabari: 轉. 這在protocol沒有寫 但在網路已討論很久. kit裡面鹽
→ jabari: 的部份殘留column內 所以在wash步驟稍微讓整個管壁都浸潤
→ jabari: 到buffer.最後260/230就會正常
推 jabari: 另外想知道有沒問題 你該選用qubet或是上agi2100看RIN值 n
→ jabari: anodrop其實看不清RNA的品質
→ jabari: 如果真的想讀 我建議你翻實驗室NEB舊的catalog
→ jabari: 或是看protocol online 裡面積滿古人的血淚
推 huuban: 一般的跑膠很夠了啦，不過如果有錢用2100當然最好
呃   大概是 如果懷疑取出的RNA可能被RNAase切成小段
在跑PCR之前要用什麼方法來確認會比較好呢?  謝謝!

大致上是知道要跑膠  只是要怎麼跑會比較好呢 @@
什麼是primer的postive control.. 謝謝


※ 編輯: baal90317 (111.243.65.124), 05/16/2015 20:49:03
※ 編輯: baal90317 (111.243.65.124), 05/16/2015 20:51:46
推 tigernaxo: 怎麼跑？不就跟DNA一樣 看rRNA還在不在
→ sylvialalala: 怕rna斷成小片段的話，跑膠看有沒有smear