Re: [求救] TA cloning相關問題

[blence ( )]

  既然提到colony PCR (cPCR)的需求
  我也回應我的觀點

  問題起源與關於cPCR的使用時機與功能
  假使24,48甚至2x48都可以作為cPCR的組數
  那不知道這個的limitation在哪裡？
  抑或熟手cPCR在3,4,或6組就足以挑到或幾乎都是candidate
  那何不直接mini還多進行cPCR篩選？

  我對傳統RE-mediated cloning有以下兩種分類
  必要步驟包括：準備insert,準備vector, ligation, transformation, mini-prep
  協助步驟包括：insert/vector cleanup, ligation-check
                colony PCR, gel&sequence check

  cPCR非核心步驟,又有gel check與定序替代
  所以我是這麼看cPCR的
  當只有一開始完全沒人帶沒人問的時候，才有cPCR的妥協
  但如果以xxtomnyxx板友熟悉操作,若cPCR能剔除的也才一兩顆，何不直上mini就好？
  因此我自認為cPCR可省略的理由至少有：
  1.無法對mini-prep預先剔除做出貢獻
  2.對太大的insert,不容易以兩端seq primer操作
  3.台製每個mini-prep約8~20元，用cPCR看不出能省經費
  4.我個人有同事協助,每少一個步驟就給對方少一個操作麻煩

  以下是我以及我的助理同事的流程
  template來源約7成自cDNA(<3kb), 2成購買clone(>3kb),約1成是gDNA

  Day 1, PCR amplify (25ul),全部拿去gel extraction
         pJET blunt-end ligation, transform
  Day 2, 早上pick up colony(3~4顆)，下午mimi-prep
         五點前定序(其中2~3顆)
  Day 3, 下午比對定序, RE cut, insert extraction或cleanup
  Day 4, ligation, transform
  Day 5, pickup colony(3顆), mini-prep, gel check

  若只是換vector
  Day 1, RE,gel extraction/cleanup, ligation, transform
  Day 2, pick up colony, mini-prep, RE cut, gel check, medi 放大
  Day 3~5,可以從medi-prep,transfection做到收cell lysate

  除了少數size太大,或序列本身不穩定
  只要星期一從cDNA的25ul PCR有微弱band，基本上下週二都可以預期做transfection
  test (而且週末不用加班)
  如果訊號夠強,也會跳過cloning vector直接送進expression vector，
  這樣五天就有medi scale plasmid
  通常有不順利都是是手上的cDNA無法在PCR放大

  回到原po的問題，顯然是對自己使用產品的不熟悉
  所以我才建議應該從protocol著手(以及其中的troubleshooting)
  或者至少先向熟悉的前輩求救，而不是繼續用cPCR在白點中撈針

  以下例子是我對我們lab用的產品的瞭解，
  根據KOD或advantageII，可以決定要送2-6管去定序比較保險
  從pJET效率，只要是colony不用跑膠就知道必有insert可以去定序
  切Fastdigest，知道多久或要不要CIP可以挑不到self-ligate
  用不同ECOS品系，可以知道長不出來跟transform無關
  gel extraction/cleanup,elute體積不該是越少越好，TM會有說明
  普通的I:V ligation，一般的10X ligase(NEB)就很方便，不必要2X
  而且vector每次用10ng以足夠，一開始切0.5~1ug以內就好
  如果該RE-cut vector沒self-ligation，冰-20可以放5年以上還可用
  上述column kit除了gel extraction，其他也都用台廠

  最後附帶一提，以下觀點也跟xxtomnyxx相反
  對於暑期生或rotation
  基於技術學習，我反而會介紹cPCR並且給予練習與嘗試機會
  但如果是要常駐碩、博班學生
  除非是自認為一定要挑一二十管而且用cPCR才是叫cloning這種自認很熟的新人外
  我自己帶就一定跳過完全不考慮去提cPCR

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  以上提到的商品試劑皆由實驗室經費自行購買
  文章內經驗分享無廠商以任何形式的贊助
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    怎樣算是序列不穩定？ (複選)
 A) Donator提到該cDNA plasmid在37度長的100%都錯的，
    要30度而且要48h才會有正確的
 B) 有一顆,mini菌液在37度長到6～8h些微變濁(mini-prep, size不對)，
    至16h完全澄清
 C) 又有顆,mini菌液在37度8~10h有變濁(此時mini是對的)，放超過20h變更濁，
    但plasmid會不見
 D) 37度plate放16h，正常大的colony都是錯，要挑比satellite小的colony才是對的
 E) RE-based insert，接進plasmid後挑去定序，每顆都有突變(indel, point m)
    都在不同位置

※ 編輯: blence (114.33.221.4), 08/02/2015 02:24:17
推 xxtomnyxx: 因為我最近就有兩個 clone 直上 mini,結果是錯的，回頭
→ xxtomnyxx: 做 cPCR發現沒有一顆菌落是對的......
推 xxtomnyxx: 雖然我只挑了 7 顆但我知道其他的要挑到應該沒什麼機會
→ xxtomnyxx: 。
推 xxtomnyxx: 然後其實你 day 2 時養 mini 也要等，如果沒其他實驗要
→ xxtomnyxx: 做還是可以做個 2 in 1，這樣可以更確定可以拿到對的 p
→ xxtomnyxx: lasmid，就挑個3、4顆然後拿 cPCR 有訊號的抽 mini，可
→ xxtomnyxx: 以避免失敗而花更多時間或浪費 mini column。
→ blence: 因為成功率高,PCR就多餘了,除了用時間做其他事,也不想助理
→ blence: 太麻煩,上面也說了,mini可能比PCR便宜喔;另外上面也有提
→ blence: 我們常只抽mini不切RE甚至不跑膠直接送定序,就是對colony
→ blence: 有信心,我們只怕cDNA沒band,只要有,很難mini會失敗
→ a90648: pJET成功率真的很高，如果是用它的話我也是直接送定序
→ Ice9: 在我們 Lab，colony PCR 並不是提高成功率的手段，是用來批
→ Ice9: 量 construct 一堆東西時，省時間的方式。Colony PCR 在我們
→ Ice9: 來看，真的對經費不友善；除非有些用到的方式比它還貴，例如
→ Ice9: 稀有RE之類的。而且，在我們Lab，碩士生的方法訓練比出不出
→ Ice9: 成果還重要。常規手段做不出來時，得找出問題和解決之道，當
→ Ice9: 然能出成果是最好，畢竟這也影響畢業速度——當然，在文章
→ Ice9: revise 期間，一切都以 Publication 為重……Orz
推 tchan: cPCR主要是省時間但是耗費較昂貴的技術，看各人怎麼選擇
推 chaunen: 請教一下 大大們是用哪種酵素來做cPCR? 我P一個clone 1塊
→ chaunen: 我只是用普通的2X mix 產物2.5k內 band都很強阿...