[求救] western 壓片疑惑

[zzxc87520 (珼珼)]

各位版大好
小的對於western blot可以說是非常之不擅長
在博班學長的帶領下data終於有稍稍好轉的跡象
但目前遇到不知該如何解決的問題
以下是實驗條件
Sample:
80ug 6xDye 煮6分鐘
-20保存

Running:
上膠 70v 30mins
下膠 120v 90mins 15%

Transfer:
濕式 300mA 90mins
PVDF 膜 100%甲醇 泡10mins以上
Transfer buffer(1:2:7=10xbuffer:甲醇：水）
Buffer會冰-20兩個小時(重複使用最多三次）
跑的時候有放冰保
跑的時候有放冰保
跑的時候有放冰保
Tank外有放冰塊保冷

Blocking:
5%脫脂牛奶 1小時 （TBST 洗3次，每次10分鐘）
1抗:
1抗:
4度c over night (抗體會重複使用）
（TBST 洗3次，每次10分鐘）
（TBST 洗3次，每次10分鐘）
2抗:
TBST 稀釋至 1:5000
室溫 1小時
（TBST 洗3次，每次10分鐘）

以下是實驗結果

https://i.imgur.com/g8oKfvP.jpg

https://i.imgur.com/c2tc9g4.jpg



圖片可以看到
圖片可以看到
在應該是蛋白的位置上有長長一條
不然就是像圖二的情形
我在壓Twist,snai1,slug的時候
常常有這種情況
不然就是全白沒有band
小的完全不知道該如何改善這件事情
請各位大大指點迷津



附上actin的data給各位參考一下
2抗稀釋至 1:10000
https://i.imgur.com/5TzimNi.jpg
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 180.217.230.109 (臺灣)
→ xxtomnyxx: 上膠 0 V ?????  這是在跑身體健康的喔XDDDD
阿哈哈哈哈為什麼我的7被消掉了，抱歉抱歉
※ 編輯: zzxc87520 (180.217.230.109 臺灣), 12/10/2019 18:48:19
→ xxtomnyxx: 你的學長做的western有這些問題嗎？單看你的步驟其實少
→ xxtomnyxx: 你的學長做的western有這些問題嗎？單看你的步驟其實少
→ xxtomnyxx: 掉了一些重要的過程，是沒寫還是真的沒有？
→ xxtomnyxx: (如：PVDF先浸甲醇再拿來transfer)
回x大，學長本人不跑western ，同學跟學妹的片子有問題大部分是背景髒或空白片，其他都是清晰的band。
※ 編輯: zzxc87520 (180.217.230.109 臺灣), 12/10/2019 18:56:03
→ xxtomnyxx: 然後我第一次看到有6x的SDS loading dye。還有二抗應該
→ xxtomnyxx: 也是要在牛奶裡吧怎麼會是TBST？不過這大概都不是主因
→ xxtomnyxx: ，你的問題比較像在transfer(包含)之前的問題
回x大，2抗會在TBST裡是有老師建議，說是背景會比較乾淨，但小的覺得沒什麼差別，通常沒有data都是空白片，6xdye是學長給的配方，我們是自己配的，實驗室都是用這個跑的。
※ 編輯: zzxc87520 (180.217.230.109 臺灣), 12/10/2019 19:05:23
※ 編輯: zzxc87520 (180.217.230.109 臺灣), 12/10/2019 19:06:49
推 mokopo: 問一下 一抗有說要用BSA泡嗎？
推 Ianthegood: actin很美啊流程應該沒有問題 確定有表現嗎 不然就是
→ Ianthegood: 抗體需要特殊處理 要不要一抗番號來一下看有沒前輩有
→ Ianthegood: 經驗的
→ blence: 你把b-actin跑膠的條件membrane拿去染snail應該就好了
回b大，我的actin跟snail是同一片膠，所以snail染成這樣我才覺得很疑惑。
※ 編輯: zzxc87520 (180.217.230.109 臺灣), 12/10/2019 21:45:16
推 qiet: 要不要改用bsa blocking & 配一抗試試，流程挺一般的沒啥問
→ qiet: 題
推 qiet: pvdf甲醇不用泡十分鐘吧，浸一下就好
推 jsi: 推Ianthegood，beta-actin很美，跑膠應該沒問題，若抗體都有
→ jsi: 照datasheet配置及反應，可能是target protein表現量低於偵測
→ jsi: 極限，用recombinant  protein或確定有表現的樣品做positive
→ jsi: control就能確定了
推 MADAOTW: 拿一抗說明書寫的比例與buf試試吧！現在還有實驗室在壓
→ MADAOTW: 片？？
→ a90648: 我們所很多都還是用壓的阿
推 joseph103331: Datasheet的常不準阿,不同廠商的膜也有差
→ joseph103331: 背景霧狀表示二抗5000有點太高,訊號不好增加1抗看看
推 agagy: 現在已經有不少便宜的掃描機器，足夠一般學術單位使用了
→ lemonteas: transfer完，可以先染個ponceau S，確認transfer有做
→ lemonteas: 成功。我跑transfer會穩壓75V，好像不是用穩流跑耶。如
→ lemonteas: 果確定transfer有成功，可能是抗體的問題，抗體搖太久
→ lemonteas: 或是抗體專一性不夠。
推 Ianthegood: 底片的sensitivity是無法取代的 沒有人isotope用掃描
→ Ianthegood: 機做的
推 tynse71864: 掃描機用久很懷念洗片阿
推 tynse71864: 另，原po的三隻抗體 (除了 actin) 都確定可以用嗎？
→ tynse71864: 有些抗體reuse效果也會變很差，是否這個原因造成的？
推 abcm1042: actin很漂亮步驟應該沒問題 感覺抗體不要重複用拿新的會
→ abcm1042: 比較好嗎 或是蛋白純化過程是不是有問題？
→ abcm1042: 煮的時間可以拉長？
→ abcm1042: 或是samplebuf配方是？有sds膠當對照嗎
推 Ianthegood: 或甚至不要煮熟 70-80度就好?
→ ktirene: 我覺得twist本身就不是很好壓，我們實驗室換過多家抗體
→ ktirene: 才找到一個堪用的~ 所以你要不要多試幾家抗體看看？
→ ktirene: btw 然後twist的1抗我會稍微配濃一點
推 yaes111: 有沒有想過是抗體爛
推 hsuaba: 有這個抗體的+ctrl嗎? 直覺是抗體不好
推 walker456: actin看來沒什麼問題 抗體爛或是sample表達少的機率高
推 xiphos: transfer沒成功會連actin都壓不好啦......
推 michealking: 把那三隻的抗體編號放上來吧......