嗯 E. coli唷 這....怪
我先說一下我的做法
PCR product purication-> RE digest->expected band gel extraction->A
vector digestion-> purification->B
A:B=3:1 ligation-> transformation-> bac culture->insert check by PCR->
amplification of picked colony O/N-> plasmid extraction-> sequence
你有做INSERT CHECK嗎
sequence結果e. coli我真不知道為啥子 你適用megablast嗎
你會有東西被E.coli污染嗎?? 再跑PCR或LIGATION時
你的RE切sticky or blunt end??
the former the higher speciticy of ligation
你的實驗室都用這個方法做的嗎 plasmid RE 種類
HOW long is ur insert?
Can u read "vector-E.coli-vector" in the one-way sequence result??
if u can, ur c- primer may have lower specifity
which means it may match sequence of vector
can u see SEE the cutting site in the head of the "E.coli"sequence??
Klenow可不去掉overhang TA 我不知道
不過 你去掉她幹麼 它應該不會影響吧 都被你RE切了的話
how about TA cloning?? it's easier and faster
or just sequence ur purified PCR product,
if it is enough and not so precious and u sure there's only "one"band
有點亂唷 我努力了
※ 引述《emily1124 (玩夠了也該收心了)》之銘言：
: ※ 引述《whimmy (peace in mind)》之銘言：
: : 問一下 你所謂的怪東西 是說SEQUENCE結果不能判讀 NNNN
: : 還是 不是你想像中的敘列 BLAST結果怪??
: : 可不說一下 你是怎麼作construct的
: : 從pcr product purification之後用的大略東西和步驟
: 怪的地方是
: sequence蠻pure的
: 用的primer是我們拿去夾insert的那兩對
: 分別從N & C讀回來....
: N端的算乾淨的SEQ
: 但是一半是讀到vector
: 另一半blast出來說是e.coli??
: C端的則是一團大混亂.....
: 總之跟我們預期的真的差超多.....
: construct做法
: pcr做完之後...enzyme digest-->gel ext(取預期size的fragment)
: -->vector digest--->ligation-->transformation
: 蠻一般的做法
: 我現在能想到的是我們原本在夾insert的時候
: somehow出了啥事...夾出來的根本不是我們要的
: 又好死不死接的進去
: 不過這也太巧了吧!!!
: 對了
: 順便問一下
: Klenow可以去掉overhang的 TA fragment??
: 有做過嗎??我是看paper寫的....
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