我說的insert check 應該是你transform 後挑24-48個colony的少量菌
豁到水裡再進行普通的pcr 確定insert size是你要的
才把那些菌增幅(養多一點啦) 再抽plsmid
有的時候因為菌長的比較密 看起來只有一個菌落但跑PCR來卻會有一條以上的band
我在想你的是不是這種
然後呀你們那兒降的方法是很routine的做了嗎
就是說你確定你們用的primer和plasmid不會有non-specific binding
※ 引述《emily1124 (玩夠了也該收心了)》之銘言：
: ※ 引述《whimmy (peace in mind)》之銘言：
: : 我先說一下我的做法
: 我的做法跟你的是一樣的唷~~
: : 你有做INSERT CHECK嗎
: 就是靠PCR product出來的size判斷
: 然後做gel extraction elute 出insert
: 沒有特別去seq insert看是不是對的.....
: : 你的RE切sticky or blunt end??
: : the former the higher speciticy of ligation
: sticky end囉~
: 最近seq回來我們拿來當template的fragment
: 用的primer是我們拿來夾insert的那兩對
: 回來的seq很正常阿.....
: 也都對阿.....
: 就是不知道後面到底出了什麼事??
: 阿阿~~~
: 一個construct做這麼久....
: 真的是快瘋了.......
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