作者goodman1 (撰寫國王的論文ing)
看板CSMU-LS89
標題Re: 跑膠的問題
時間Sat Mar 18 00:54:35 2006
※ 引述《sGoat (無三小羚羊)》之銘言：
: ※ 引述《goodman1 (撰寫國王的論文ing)》之銘言：
: : 我是用2%的agarose跑ssDNA
: : 有時候會很不幸的出現整條都是smear 囧rz
: : 請問要怎麼避免掉smear的出現啊
: : 問題是出在PCR的過程還是跑電泳的過程？（還是製膠的過程？）
: : <(_ _)> 剛溫
: 先問一下...
: 這是正常一般PCR還是甲基化敏感PCR...
^^^^^^^^^^^^^
是這個 @@
: 一般PCR的話問題可能在PCR primer不夠好...
: 怎樣算不夠好呢...
: 以程式的篩選方式來看...
程式 @@?
: 1.primer self dimer
: 2.primer pair dimer
: 3.primer loop
: 這三樣東西多...
: 或是1.2.的△G太高會造成產物smear
: (因為primer dimer會自己粘自己產生一堆垃圾)
"△G" <囧>
: 排除以上因素的話...
: 就是primer Tm值沒有橋好...
: 兩個的Tm值要相近,最好差在5度以內...
: 你annealing的溫度最好比Tm值比較低的primer再低五度...
囧 我一直以為溫度高會比較好耶(可以問原因嗎?) 那我下次改溫度看看好了
: 還有你是拿啥東西當template...
: plasmid ? 還是cDNA ?
: template的質也會影響產物...
: 以上...x
我的DNA是抽血的dsDNA
bisulfite處理後變成ssDNA
跑完PCR變成dsDNA
所以跑膠的時候應該是dsDNA
這樣有回答到問題嗎?@@? (理解力差 Orz)
缸溫 <(_ _)>
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◆ From: 59.113.195.221
推 Anvec:有軟體可以預測 primer的專一性 或有沒有形成dimer 03/18 09:50
→ Anvec:我也覺得溫度高 primer比較專一耶 03/18 09:52
推 sGoat:△G是活化能,解離需要的能量,低的話容易解離,不易形成dimer 03/18 14:21
→ sGoat:溫度高專一是指你primer Tm值高,所以專一性高... 03/18 14:23
→ sGoat:annealing溫度太高會讓你primer粘不上template... 03/18 14:33
推 goodman1:之前靖鳴老大也有推薦我一個軟體，可是我還是搞不懂 Orz 03/18 18:34
→ goodman1:嗯嗯，那我下次改溫度再跑一次看看，太感謝了 ><" 03/18 18:34