推 joseph0712:羊羽人右辛苦了^^ 04/20 23:07
同學：
因為Ch17共筆後半部份沒有收錄進來，所以內容po在板上，請見諒！
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p.43
NCBI:國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，簡稱
NCBI)是美國國家醫學圖書館(NLM)的一部分(該圖書館是美國國家衛生研究所的一部分)。
NCBI位於馬里蘭州的貝塞斯達，建立於1988年。NCBI保管GenBank的基因測序數據和
Medline的生物醫學研究論文索引。所有的這些資料庫都可以通過Entrez搜索引擎搜尋。
NCBI的主要服務項目有，基因序列的“註冊”、搜尋、比對，以及著名的整合性資料庫搜
尋系統Entrez,除此之外NCBI也開始提供蛋白質三級結構的服務。
Physical map
p.45上
Physical map是人們為了更進一步提升基因圖譜的解析度，而發展出的第三種基因分析法
，與第二種方法(genetic recombination)不同的是，Physical map以人工的方法對基因
做處理，並不像以往只用天然的工具(Ex:PCR)，因而可以將基因切割成更小的片段，讓解
析度大幅的提高。(由原先的1mega bp提高到72K bp)
Radiation hybrid and STS markers
p.46
STS(sequence-tagged site)是人類基因以人工方式(通常為輻射線)，所切割出具有獨特
性的DNA片段。(長度約200-500base pair)
p.47
在製作完成後，STS即被放置入囓齒鼠類的細胞(其基因為完整的)中，進行基因的融合，
以利於之後更進一步的分析，此種方法即稱為radiation hybrid(RH)。
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(對照第47頁的上下兩張ppt)
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打斷的細胞有個現象：2個marker愈近愈不容易被X-ray打斷，愈容易同時出現
Radiation hybrid map
p.48
就如同crossing-over(互換)一樣，兩個基因距離越位接近，被輻射線打斷的機會就越小
，這樣的結果產生了不同型式的片段，在與其他細胞融合後，我們就可以檢驗在細胞中所
含的STS種類，以出現的頻率判斷兩基因的相對距離，藉此拼湊出完整的基因圖譜。
p.48下
可調整輻射劑量，來決定STS被切割的長度。
X-ray能量越高→打得愈碎→解析度愈高
p.49上
各種不同的radiation hybrid map。
p.49下-P.54
一般而言，基因圖譜並不會僅以一種方法進行分析，而是多種方法相互的配合，以清楚得
確定基因所在的位置資訊，有利於我們對基因資料的處理。
Physical map整理
分析策略:Physical map
種類：(1)chromosomal or cytogenetic maps
(2)radiation map
(3)sequence map
分析方法：Radiation hybrid、STS markers
解析度：約72K bp
p.55下
什麼是“BAC”
●細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome)─從某些外來基因體中取出的巨
大片段(平均15萬鹼基對(kbp))，再細菌裡繁殖。
p.56上
下圖對於圖譜做一番整合：
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(對照第59頁上面那張ppt)
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p.56下
使用序列標誌點(STS，sequence-tagged site)讓重疊的複製體有規律
●為了產生定序(sequencing)的標記，基因圖譜(genetic map)和物理圖譜(physical
map)被製作了出來
●一個完整的基因庫應該要產生能指出染色體中複製片段的規律的完整連續圖譜(contig
map)
p.58下
DNA定序
●化學定序
─Maxam-Gilbert定序
●鍊末端終止法(chain termination method)
─Sanger定序
─染料終止子序列(dye terminator sequencing)
●大規模的定序策略(large-scale sequencing strategies)
─引子逐步定序(primer walking sequencing)
─散彈槍定序(shotgun seguencing)
p.59上
自動化DNA定序
●Sanger定序法：1974年由Frederick Sanger研發出的基礎鍊末端終止法。此法造成所有
可能的單股DNA分子和給定的模板互相配對，並且從共同的五碳端開始。
p.59下
Sanger定序法
●Sanger的DNA定序法包含一次又一次的複製DNA片段，每次都會藉由合併三磷酸雙去氧核
苷酸(dideoxynucleotide triphosphate)(並非一般的三磷酸去氧核甘酸)提早終止複製序
列。
●三磷酸雙去氧核苷酸在三碳端(3-carbon position)fm, 缺少一個-OH基並無法在三碳端
上再增加其他的核苷酸，因此妨礙了進一步的DNA合成。
測序過程需要先做一個PCR反應。PCR過程中，雙脫氧核醣核酸(dideoxynucleoside
triphosphate)可能隨機的被加入到正在合成中的DNA片段裡。由於雙脫氧核醣核酸多脫了
一個氧原子，一旦它被加入到DNA鏈上，這個DNA鏈就不能繼續增加長度。最終的結果是獲
得所有可能獲得的、不同長度的DNA片段。
p.60上
自動化定序法
●依然使用Sanger的鍊末端終止法，但是更準確並且更快速。80年代和90年代許多重要的
進展提供了此法的可行性。
●這些新的定序大大地增加定序的速度，讓基因體(genome)規模定序成真。
p.60下
基因體學(genomics)
●基因體定序
─自動化法使其有可行性。
─科學家→較少的數據產生(data generation)，較多的數據分析(data analysis)。
p.61下
引子逐步定序(Primer walking sequencing)
Primer walking is a very common and effective sequencing strategy. In this
procedure a primer designed from a know sequence is used to extend sequence
information into a previously unknown region. The new sequence information is
used to design the next primer, and the process is continued until the entire
sequence of the entire sequence of the region of interest is determined.
﹝弱點﹞
●需要大量非現成的(custom-made)寡核苷酸(oligunucleotide)引子，花費極大(一個引
子需要美金三至五元)。
●伴隨著所需的合成引子延遲。
p.61下
散彈槍定序(比引子逐步定序更有效率)
●為了組合(assembly)需要引發大量的多餘(redundant)DNA序列(一般來說是基因體6至15
倍的大小)。
p.62上
兩種定序DNA的方法
●Top and down法─Hierarchical定序：
首先，先有系統的辨別染色體上的標誌序列(mark sequences)，如此一來每一段要定序的
DNA片段都會包含一個標誌(圖a)。這些最簡易標誌就是限制酶的切割辨識位。
有些限制酶能夠辨別八到十二個特別的DNA鹼基對，而不是平常的四至六個鹼基對。對於
一個有幾百萬個鹼基對的DNA分子而言，這些特殊識別位並不常見，因此被這類限制酶切
割過的DNA，都變成大型的DNA片段。這些巨大的DNA片段可嵌入特殊載體─bacterial
artificial chromosome(人工細菌染色體，簡稱BAC)中，載體BAC可攜帶長達二十五萬鹼
基的DNA，並在細菌體內進行大量的複製，建立基因庫(DNA library)。
這些DNA碎片可藉由使用標誌序列，被有次序的排列在基因圖上。為了要排列這些DNA片段
，可比較由不同限制酶切割的基因庫，如果由兩個不同限制酶切割的大DNA擁有相同的標
誌，意味著兩片段重疊。這個方法整體來說是有效的，但是卻很緩慢。
●Button up法─散彈槍定序：
有別於尋找標誌、切割片段、然後定序，所謂的「散彈」採用亂槍打鳥的方法，把DNA隨
意的切成小片段，再讓超級電腦來決定記號，即找出重疊(overlap)的部分(圖b)，接著直
接進行排序的工作。
散彈槍定序法較分級定序法為快。自從精密電腦與超級軟體問世之後，讓基因定序的工作
更有效率，且校正功能讓錯誤大減。擁有一億八千萬bp的果蠅基因即是利用散彈槍定序法
在一年之內被定序完畢。
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(對照第62頁上面那張ppt)
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p.63下
人類基因體定序的計畫目標
●辨識(identify)人類DNA中將近20000-25000的基因。
●終止(determine)組成人類DNA的三十億化學鹼基序列。
●將此訊息儲存(store)在資料庫。
●改善(improve)數據分析的工具。
●將相關科技轉移(transfer)到私人部門。
●對付(address)計畫中可能會產生的倫理的、法律的，以及社會的爭議(ELSI)。
p.64上
註解(annotate)人類基因體
●在三十二億鹼基對中，少於百分之二是編碼區(coding region)，其中包含總數21000個
基因。
●一般一個基因有27000個鹼基對。
●超過百分之五十的基因體是由高度重複序列(highly repetitive sequences)所構成。
●人類的基因體幾乎(99.9％)是相同的。科學家已經畫出超過兩百萬的單一核苷酸多樣性
(SNPs,single-nucleotide polymorphisms)─即在少數人群(至少百分之一)裡會變異的鹼
基。
●基因並不會被平均分配到基因體中。
●許多基因的功能依然未知。
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(對照第64頁上面的ppt)
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p.77上
蛋白質體比基因群組複雜
透過基因序列的解碼，我們發現人類的基因只有預測的三分之一，這是因為一個基因能夠
傳達多於一個的蛋白訊號，交替割讓我們找到同一基因轉錄成mRNA上的外顯子，轉譯後的
修飾也增加了基因能產生的蛋白的形式。因此，所有由有機體製造出來的蛋白質我們稱為
蛋白質體(proteome)，遠比基因組(genome)來的複雜。許多蛋白少了些肽，有些接上醣類
、有些磷酸化，因此蛋白群組比基因群組複雜，一基因一蛋白理論也因此被推翻。
p.78-80
Single Nucleotide Polymorphism(SNPs)
單核苷酸多型性
請參考講義圖片
by 黃翔
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