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氮是植物生長所必需的主要營養元素。在農業生產中，氮被視為衡量土壤肥力的一個重要
指標。它是農作物獲得長期穩定高產的基本條件。
高等植物只能利用以離子形式（NH4和NO3）結合的氮。所以，空氣中的分子態氮只有
通過工業或生物固定轉化成其他化合物，才能進入生物體系統。
自然界中通過微生物將分子氮轉化為含氮化合物的過程稱為生物固氮。
固氮作用是地球上氮素循環的一個重要部分。自然界中由固氮生物完成的分子氮向氨
的轉化占2/3以上，而通過工業合成或其他途徑合成的氨只有1/3左右。
禾穀類作物是人類賴以生存的糧食作物。由於缺乏共生固氮作用和大多數土壤缺乏氮
素，因而氮肥往往成為農業增產的限制因素。為此，當前世界迫切需要開闢氮素肥源，以
增產糧食。
70年代以來，人工合成氮素化肥的能源耗費和環境污染問題開始顯露出來，於是生物
固氮研究更加受到世界各國的重視。現代農業科學中生物固氮已成為極富挑戰性的研究課
題。
長久以來，人們始終樂此不疲的探究著生物固氮的途徑和機理，其最終目的是： ·
提高現有固氮生物的固氮能力；
·提供高效優質的微生物肥料，為農業開發肥源；
·用分子生物學等方法促使不固氮作物固氮；
·人工模擬固氮酶在常溫常壓下還原分子氮，使氨的工業合成有一個歷史性突破。
一、生物固氮及其基本過程
1、固氮微生物的類型
（1）自生固氮微生物
大多數固氮微生物在土壤或水體中自行生活，稱為自生固氮微生物。分好氧與厭氧兩
種。好氧性自生固氮菌在我國分佈廣、種類多，常見的有圓褐固氮菌和棕色固氮菌等。它
的固氮能力較強；厭氧性自生固氮菌也稱巴氏梭狀芽孢桿菌（產生芽孢時菌體呈梭狀），
嚴格厭氧。
（2）共生固氮微生物
共生固氮微生物是在植物體內和植物共同生活產生固氮作用的微生物。共生固氮微生
物可以分為兩類：一類是與豆科作物互利共生的根瘤菌，以及與榿（音漆）木屬、楊梅屬
和沙棘屬等非豆科植物共生的弗蘭克氏放線菌；另一類是與紅萍（又叫滿江紅）等水生蕨
類植物或羅漢松等裸子植物共生的藍藻。由藍藻和某些真菌形成的地衣也屬於這一類。
能與非豆科植物共生結瘤固氮的微生物是一種放線菌（Frankia）。已報道有8科、24
屬、200（400？）多個種的木本雙葉植物與之共生結瘤固氮。這類植物統稱為放線菌結瘤
植物。它分佈廣、適應性強，在各種生態條件下都能生長。它們固氮力強大，是陸地生態
系統中的重要供氮系統。
（3）聯合固氮微生物
有些固氮微生物如固氮螺菌、雀稗固氮菌等，能夠生活在玉米、雀稗、水稻和甘蔗等
植物根內的皮層細胞之間。這些固氮微生物和共生的植物之間具有一定的專一性，但是不
形成根瘤那樣的特殊結構。這些微生物還能夠自行固氮，它們的固氮特點介於自生固氮和
共生固氮之間。這種固氮形式叫做聯合固氮。
在農業生產中，利用共生固氮微生物與植物的固氮作用是極其重要的，這其中，又以
根瘤菌與寄主豆科植物的共生最重要。（表 ）。
2、根瘤菌與豆科植物根的共生
1886年德國學者H·赫爾利格爾首先發現豆科作物的根瘤具有同化利用N2的能力。
在過去的30年間，關於固氮根瘤菌同豆科植物之間的遺傳共生問題的研究已經取得了
很大進展。已知根瘤菌屬中有十幾種根瘤菌。其單獨生存時並不進行固氮，只有與豆科植
物建立了共生關係時才能進行正常的固氮作用。
（1）根瘤菌侵染豆科植物根部的過程
根瘤菌侵染豆科植物的根部，形成一種具有複雜結構和高度分化的特殊植物
器官——根瘤。固氮作用就是在根瘤所提供的厭氧環境中進行的。這個過程大致可概括為
：
土壤中的根瘤菌吸收豆科植物的根分泌物後產生鞭毛→貼附於根毛→根瘤菌分泌生長
素使根毛捲曲→根瘤菌大量繁殖，形成感染絲狀體（侵染線）→刺激寄主根細胞分裂→根
瘤形成→根瘤菌發育成能固氮的「類菌體」，在固氮酶、植物豆血紅蛋白等共同作用下，
開始固氮過程（下圖）。上述每一步都要受到植物基因和固氮菌基因的控制。
由此可看出，根瘤菌的運動、繁殖及至固氮功能行使，都需寄主供給碳水化合物，但
它同時將其所固定的氮供應給寄主，以此「互惠互利」，互相依存。如下圖所示。
（2）根瘤菌的寄主專一性
根瘤菌和豆科植物相互作用的一個顯著特徵是其宿主特異性。不同的豆科植物寄主需
要不同的根瘤菌。
研究者們發現，從不同種豆科植物根上分離的根瘤菌在形態和培養特性上彼此相似，
但是回接植物都表現很強的寄主專一性。往往在其他種的豆科植物上不能存活。如從羽扇
豆根上分離出的根瘤菌不能在豌豆上形成根瘤，反過來也一樣。來自豌豆、扁豆和菜豆的
根瘤菌能夠在這一群豆科植物的各個種上結瘤。因此，豌豆根瘤菌和羽扇豆根瘤菌之間的
區別可以根據寄主專一性來判斷。根據根瘤菌的寄主專一性，可將根瘤菌分為六個互接族
群：苜蓿群、車軸草群、豌豆群、菜豆群、羽扇豆群、大豆群。同族的寄主範圍相同，不
同族的寄主範圍不同。
形成互接種族的原因：根瘤菌與宿主豆科植物的相互識別涉及根瘤菌表面粘多糖和植
物凝集素的相互作用。根瘤菌胞外粘多糖包括異源多糖、中性β糖原、脂多糖等。它們可
能是信號分子，或者是產生信號的物質分子，或者是侵入過程所需的粘性物質。凝集素是
一類植物糖蛋白，它一端與根瘤菌的次級受體結合，另一端與宿主植物根毛上的類似受體
結合，以辨認和結合。只有同族豆科植物根毛分泌的蛋白質與同族根瘤菌細胞表面的多糖
物質才能產生特異性結合。
3、固氮酶
固氮作用必須在固氮酶的催化下才能發生。一些重要的進展也是始自固氮酶的分離。
該酶在0℃下都很不穩定，在有氧氣存在時也很不穩定，所以直至1965年才得到其粗製品
。目前，已從許多種固氮生物中分離出這種酶。
（1）組成：鉬鐵蛋白+鐵蛋白
一般的固氮酶都是由鉬鐵蛋白和鐵蛋白組成。這兩種蛋白單獨存在時都不呈現酶活
性。只有二者整合在一起，形成復合體後，才具有催化氮還原的能力。
（2）結構：
‧‧鐵蛋白：由2個相同亞基組成的二聚體。每分子二聚體中含有4克原子鐵和4克原
子酸不穩定性硫，組成一個[4Fe-4S]的原子簇。代表不同屬種的多種固氮生物固氮酶鐵蛋
白的一級結構都已測定。其中都不含色氨酸，酸性氨基酸均高於鹼性氨基酸。各種屬間的
同源性為45%~90%。說明鐵蛋白的基本結構是較為保守的。目前，棕色固氮菌固氮酶鐵蛋
白的晶體結構已在2。9Å分辨水平進行了測定。
‧鉬鐵蛋白：由2個α亞基和2個β亞基組成的四聚體（α2β2）。一些固氮生物的固
氮酶鉬鐵蛋白的一級結構也已測定。其氨基酸序列有47%~66%相似，保守性都相當高。尤
其是半胱氨酸，其位置往往相同或相近，推測是與鐵、鉬形成配位鍵所必需。鉬鐵蛋白α
亞基的N末端區的長度與同種鐵蛋白的C末端的長度具有對稱關係，這種對稱關係可能會決
定活性固氮酶復合體的形成，並與不同種的兩組分蛋白互補時，顯示與酶活性密切相關。
現在棕色固氮菌和巴氏梭菌的鉬鐵蛋白晶體結構分別完成了2。9Å 和3。0Å的X衍射分析
（ 1992年）。
‧固氮酶組成的多態性
上述由鉬鐵蛋白和鐵蛋白組成的固氮酶系統（MoFe）曾一度被認為是固氮微生物中起
固氮作用的唯一系統。但最近20年來的發現動搖了這一觀念。1980年Bishop等發現在棕色
固氮菌中存在著另一套缺鉬條件下使用的由釩鐵蛋白和鐵蛋白組成的固氮酶系統（VFe）
。這被稱為第二套固氮酶系統。這一系統已在一些固氮生物中得到證實。近年，在棕色固
氮菌中發現了不含鉬和釩的第三套固氮酶系統，它也是一種雙蛋白系統（FeFe）。
第二套和第三套固氮酶系統、固氮基因的差異、以及一些新的發現，都給生物固氮研
究提出了一系列生理生化、遺傳與進化方面的問題，對這些問題進行深入的研究，將有利
於揭開生物固氮催化機理之謎。
（3）特性
·對氧的敏感性：固氮酶對氧極為敏感。氧對固氮生物是有害的，它既阻遏固氮酶
的合成，又破壞固氮酶活性。而好氣固氮微生物又離不開氧。所以高效率的固氮作用一般
是在微氧條件下進行。因而固氮生物都有其特定的防氧機制。
固氮酶防氧機制：
（1）分隔保護：例如藍藻的固氮功能主要在異形胞中進行，這種細胞外有一層防氧
進入的糖脂外膜，胞內缺少光解放氧的PSⅡ，其中戊糖磷酸途徑的兩種酶活性較低，而超
氧化物歧化酶和脫氫酶活性都較強，從而使異形胞保持微氧環境，避免了氧對固氮酶的傷
害。
又如豆科植物的根瘤中，由根瘤菌演變來的類菌體外有一層類菌體周膜，瘤的內皮
層內側細胞排列緊密並形成間隙，這兩者都參與氧進入根瘤的調節。並且，根瘤內還含有
作為氧載體的豆血紅蛋白，在氧分壓高時吸氧，於是，瘤中氧濃度降低，保護固氮酶免受
氧的傷害；在氧分壓低時則放氧，保證氧化磷酸化的進行。從而滿足固氮過程對能量的需
求。
（2）呼吸保護：即當固氮微生物細胞中氧分壓高時，通過劇烈增高呼吸，消除耗固
氮酶附近的氧，從而保護固氮酶。這是極耗能的過程。
（3）構像保護：在固氮酶周圍氧分壓過高時，活性「關閉」，氧分壓下降後，活性
「啟動」。這種現象是由於固氮酶與一個或更多的穩定因子如蛋白質、磷脂等結合改變構
像而得到保護。如在棕色固氮菌中固氮酶常與一種耐氧的2Fe—2S蛋白（Fe—SH蛋白或稱
Shethna蛋白）結合形成一個大復合體而得到保護等等。
氧對固氮酶的傷害，也是阻礙固氮生物應用的一個大問題，是當今研究的熱點之一
。
·異種兩組分的交叉互補性：不同來源固氮酶的鐵蛋白和鉬鐵蛋白可以交叉組合。
但物種間仍具有明顯的特異性。一般生理類型和親緣關係近的互補組合能力強；反之，則
不易組合或組合後沒有催化活性。互補後的固氮酶活性遠不如同一來源的高。說明彼此間
有共同的活性中心和作用機理。至於兩種蛋白如何結合，為什麼異源結合後活性表現大相
逕庭？這些問題至今懸而未決。
·底物的變通性：固氮酶是多功能的氧化還原酶，它的分子量很大，但底物卻很簡
單。除了還原N2外還能還原多種類型的底物。其中大多數的分子末端都具有NN、NC或CC的
三鍵或潛在三鍵。如乙炔、丙二烯、環丙烯等，都是生物界少見的。目前新底物還在不斷
被發現。這些底物雖然沒有生理意義，但是有的專性強，檢測簡便，如乙炔，可以作為測
定固氮酶活性的主要方法。有的可以作為鑒定是否存在固氮酶的依據，如環丙烯。許多底
物還可以用以探測固氮酶絡合部位等等。
4、生物固氮過程
（1）固氮酶的基本酶促反應
固氮酶蛋白所催化的固氮反應，由於三維X—射線晶體結構研究的結果，使其有可能
在原子水平上進行分析。反應的基本過程可表示如下：
即：N2+16MgATP+8e-+8H+ → 2NH3+16MgADP+16Pi+H2
在上面的圖示中，電子供體（還原劑）將電子輸送給固氮酶體系，降低體系的氧化還
原電位，以具備催化還原底物的能力。這一系列活動是從鐵蛋白接受電子開始的。鐵蛋白
接受電子後呈還原態，與鉬鐵蛋白相結合形成復合體，在MgATP參與下將電子經鉬鐵蛋白
傳遞給底物N2，使之還原成產物NH3。在底物氮存在時，部分電子經過固氮酶和ATP實現固
氮所固有的放H2反應。
天然的電子供體在不同固氮微生物中略有差異。有鐵氧還蛋白（Fd）、黃素
氧還蛋白（Fld）、紅素氧還蛋白（Rubredoxin）等。在離體實驗中，通常用低電位（—
400mV）的人工電子供體連二亞硫酸納（Na2S2O4）代替Fd或Fld。
固氮過程是一個相當複雜的過程。如下圖所示。
（2）固氮酶催化機理
英國的Postgate綜合近年來各實驗室的研究成果，提出了一個固氮酶催化機理模型。
該模型內容如下：
氧化的鐵蛋白從還原態的電子供體如Fld、Fd等接受一個電子，變成還原態鐵蛋白，
在MgATP協同作用下，鐵蛋白與鉬鐵蛋白結合，形成復合體，傳遞電子給鉬鐵蛋白，同時
伴隨ATP水解成ADP+Pi，鐵蛋白又恢復為氧化態。鐵蛋白和鉬鐵蛋白解離。如此循環2次後
，N2取代2H結合到鉬鐵蛋白上，而釋放出H2。再陸續接受6個電子後，經過形成E=N—NH2
和E=M中間物，最後釋放出NH3。
二、共生結瘤固氮的分子基礎
1、根瘤菌基因
（1）結瘤基因：根瘤菌—豆科植物共生固氮的建立，需要大量的根瘤菌基因參與。與
結瘤有關的基因可分為共同結瘤基因和宿主專一結瘤基因兩群。
共同結瘤基因：為細胞分裂及宿主根毛彎曲所必需。若這些基因中的一個發生突變，
則不能結瘤。就核苷酸序列和功能來說，這些基因似乎是保守的，在不同根瘤菌之間可以
互換。
宿主專一結瘤基因：參與宿主選擇。並與根毛捲曲的位細胞分裂的效率及持久性有關
。這些基因是不保守的，具根瘤特異性。在不同根瘤之間不能替換。由於這些基因的生化
功能還不很清楚，因此暫時只能以「共同」和「宿主專一」稱呼它們。
（2）結瘤基因的調節基因
（3）固氮基因
根瘤菌的固氮基因一般分為兩群：
nif基因：與克氏肺炎桿菌固氮系統同源。為共生固氮所必需。
fix基因：與克氏肺炎桿菌固氮系統不同源。功能尚不甚清楚。
目前研究較為深入的固氮基因：苜蓿根瘤菌、豌豆根瘤菌、大豆根瘤菌的固氮基因。
苜蓿根瘤菌的固氮基因（6個nif基因和14個fix基因）分佈於200kb的大質粒上，豌豆的
nif和fix連鎖較緊，也位於質粒上。快生型大豆根瘤菌的固氮基因也在大質粒上，而慢生
型大豆根瘤菌的所有固氮基因（14個nif和fix基因，分屬9個操縱子）均位於染色體上。
2、豆科植物基因
（1）早期結瘤素基因：在根瘤形成階段表達的基因，該基因的表達與感染
過程有關。有實驗表明，早期結瘤素在細菌與宿主根系接觸後一周內即出現在無菌感染的
「空瘤」內。說明宿主和細菌之間相互作用以及共同結瘤基因的激活對早期結瘤素基因的
表達是必需的。如大豆早期結瘤素N—75，有可能作為一個細胞壁蛋白，在早期成瘤過程
中起作用。
（2）晚期結瘤素基因：在根瘤發育後期表達的基因。晚期結瘤素參與根瘤
中的固氮和氨同化。如豆血紅蛋白（Lb）是晚期結瘤素中最具代表性的一個。現已鑒定出
了4個豆血紅蛋白基因和2個豆血紅蛋白基因的3個內含子。豆血紅蛋白基因及別的晚期結
瘤素基因，都只特異的在根瘤中轉錄，並且多數晚期結瘤素似乎與豆血紅蛋白是協同表達
的。
早期和晚期結瘤素基因的表達及功能行使與特定的共生階段相吻合。因此，研究結瘤
素基因表達系統的分子基礎顯然是富有吸引力的。近十幾年來，結瘤素的鑒定、結瘤素基
因的克隆及表達的分析都頗有進展。目前，有關結瘤素的研究
主題有：基因表達的調控方式、基因產物的細胞學定位以及由RNA序列分析所得到的信息
判斷結瘤素基因間的同源性。
三、生物固氮的基因工程
把生物固氮的基因工程運用於農業生產，目標主要有2個：一個是把非豆科
作物，尤其是禾穀類作物轉變成固氮作物；二是提高現有固氮作物的固氮能力。
使非豆科植物轉變為固氮作物
要使普通的非固氮植物的細胞，從遺傳上轉變為具備固氮能力的特殊細胞，必須具備
如下四個條件：
‧‧‧‧ 固氮菌的全部固氮基因都應能在同一植物細胞中適當的表達；
‧ 固氮酶復合體能夠恰如其分的加工和組裝；
‧ 具有一個厭氧的微環境；
‧ 提供能源ATP和NADPH。
要實現上述條件，是一項十分複雜而艱巨的工作。可能的途徑有：
‧ 用帶有固氮基因的質粒轉化植物細胞的葉綠體。從而在葉綠體基因啟動子的控制下
進行正常的表達。但固氮酶的氧抑製作用仍然是一個難以解決的問題；
‧ 把豆科植物的結瘤基因導入其他作物細胞，使之能夠對固氮菌的感染作出恰當的反
應；
‧ 改變根瘤菌的遺傳結構，使它能與非豆科作物的根結合，並形成根瘤，從而使非豆
科作物獲得固氮能力。即擴大根瘤菌的宿主範圍。
‧ 直接把固氮基因導入非豆科植物。該途徑比較困難。原因有二：其一，固氮酶復合
體對於氧的抑製作用十分敏感，若直接將固氮基因導入非豆科植物，該受體作物很難為固
氮酶提供適合的厭氧環境；其二，由於豆科植物根瘤菌固氮所需的ATP幾乎占植物總量的
1/5，因此也要求新形成的固氮植物必須具有極高的ATP形成速率，方可使能量供求平衡，
進而達到固氮的目的。而這也並非易事。但是作為一種嘗試，70年代末科學家們已把克氏
肺炎桿菌的固氮基因轉入大腸桿菌，使大腸桿菌也能直接利用空氣中的氮。日本科學家將
方法稍作變通，把固氮基因轉移到水稻根際微生物中，結果可使這種微生物給水稻提供
1/5的需氮量。
固氮螺菌的發現：1979年，巴西科學家杜柏林納（Doberiner）首次證實能與禾穀類
作物根際聯合共生固氮的根際微生物。並對其分子生物學特性進行了較細緻的研究。該類
菌的固氮效率雖不及豆科植物根瘤菌，但它能與玉米、水稻、
小麥等禾本科作物共生固氮，而且分佈範圍廣，又能產生植物生長素，因而日益受到人們
的重視。隨著對固氮螺菌研究的日益深入，或許有可能為禾穀類作物固氮開闢一條希望之
路。
提高現有固氮作物的固氮能力
接種高效固氮的根瘤菌劑。但接種的高效固氮根瘤菌在競爭結瘤時往往競爭不過土著
根瘤菌，從而使形成的根瘤實際上多為無效根瘤。嚴重影響了固氮效果。為了克服這一點
，人們嘗試的方法主要有2種：一是結合施用抗菌素來抑制土著根瘤菌；二是結合接種對
土著根瘤菌有抑製作用的拮抗菌。
提高現有固氮作物固氮能力的研究內容
（1）將固氮效率高的大豆根瘤菌固氮基因簇導入高結瘤能力的大豆根瘤菌中
（2）將大豆根瘤菌nifKD和nifH基因導入高結瘤能力的大豆根瘤菌。
（3）將外源共生基因導入豆科作物根瘤菌，提高其結瘤或固氮能力。
（4）培育具抗藥基因的根瘤菌。
主要參考資料：
1、《固氮之光——共生固氮體系中最佳結瘤固氮控制模型的研究》
洪國藩 宋鴻遇主編 湖南科技出版社1997.8
2、《植物發育的分子機理》許智宏 劉春明主編 科學出版社1998.1
3、《第二次綠色革命—21世紀的農業》劉榮樂編著 科學技術文獻出版社1995.7
4、《基因工程與農業》丁勇 吳乃虎等編著 科學技術文獻出版社199547
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人類之所以偉大，正在於他是一座橋樑而非目的；
人類之所以可愛，正在於他是一段跨越與完成。
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