(南京農業大學園藝學院 南京210095)
果樹種質資源是果樹遺傳育種的原始材料,在果樹育種中占重要的位置。世界各國都很重
視果樹種質資源的搜集和保存工作。果樹是遺傳物質常有變化的異交植物,遺傳物質複雜,
通常以嫁接來繁殖;其種質資源的保存不同於遺傳均一的自交植物。尤其是熱帶果樹,均以
嫁接方法繁殖,其種子大多為難馴化種子。最近?????(國際植物遺傳育種委員會)和部分國
家已開始此項研究並取得了成績。
1 果樹種質資源保存地點
1.1 保護區把天然的生態環境列為保護區,如國家級公園,國家級自然保護區等方式,象新
疆新源縣的野果林,福建莆田的宋荔等。但這種保存方式很難完全以人力來進行控制。
1.2 田間集中保存法以植物園、標本園、果園等形式保存,如馬來西亞建立的油椰子園,
印尼100??2的可可椰子園,中國的66.666??2芒果園和33.333??2的油梨園,菲律賓的香蕉園
等,管理栽培容易,且能獲得經濟效益。
1.3 種質資源圃種質資源圃就是集中定植種質資源到適合果樹生長的、有一定生態代表
性的圃地,以長久保存。原則上喬木果樹每種5株,灌木和籐本10～12株,草本20～25株,重
點品種保存數量可以適當增加。我國目前的種質資源圃有:１梨、蘋果圃:遼寧興城;２葡
萄、桃圃:河南鄭州;３柑桔圃:四川重慶;４５桃、草莓圃:北京和南京;６棗、葡萄圃:山
西太谷;７李、杏圃:遼寧熊岳;８柿圃:陝西眉縣;９沙梨圃:湖北武昌;(10)核桃、栗圃:山
東泰安;(11)龍眼、枇杷圃:福建福州;(12)香蕉、荔枝圃:廣東廣州;(13)寒地果樹圃:吉林
公主嶺;(14)山楂圃;遼寧瀋陽;(15)特有果樹、砧木圃:雲南昆明;(16)新疆名特果樹圃:新
疆輪台。以上種質資源圃1989年全部建成通過驗收。
1.4 原生境保存原生境保存是指在自然生態環境下保存野生植物群落或農田中的栽培植
物種群,這些種群是農業生態系統的一部分。一般來說,產生一種植物基因遺傳多樣性的原
因有以下方面:(1)未受人為選擇影響的自然選擇;(2)多變化的耕作制度中植物進化、選擇
和適應;(3)有目的的正規育種。傳統的耕作制度也能產生植物遺傳多樣性。原生境保存的
目的是既保存遺傳資源,又保護產生遺傳多樣性的進化環境。相對異生境來說,原生境保存
能使植物保持進化和對其環境的適應能力;保存所有水平的多樣性,即生態系統多樣性、物
種間多樣性和物種內多樣性;改善貧困農民的生活;維持或提高農民對遺傳資源的控制和獲
取能力,通過選擇他們喜好的農藝性狀和品質性狀而影響到一個種群的遺傳結構。他們選
擇一種特定的農田管理措施,或在一個特殊的微環境下種植一個作物群體,這些都可能影響
到一些基因型的存亡;應把廣大農民納入到國家植物遺傳資源保護系統中。在果樹上,農民
通過選擇砧木、接穗及果樹生存環境同樣影響果樹的遺傳多樣性,如芽變。
1.5 室內保存營養器官保存 多採用枝條和芽,但有時也採用根部保存,一些果樹的根具
有再生植株的能力,如石榴、番石榴等。生殖器官保存 一般採用花粉和種子保存。花粉
的缺點是只有半套基因,因而必須是能再生成植株的花粉,才具有保存價值。對於遺傳物質
不均一的果樹而言,種子保存時必須有相當數量才能保存全部或大部分基因。外植體培養
保存 可分為原生質體、細胞或器官保存,其中以莖尖和分生組織培養的短期效果較佳。
2 不同器官的保存方法
2.1 種子採用種子保存種質的,主要用於野生果樹、砧木材料、無融合生殖類型,種子繁
殖的果樹如番木瓜、椰子,以及某些實生繁殖的核桃、板栗、桃、杏等的群體品種。嚴格
地說,果樹種子後代的變異大,不能作為遺傳上定型的繁殖材料,因此實用價值有限。但利
用種子貯藏是簡便而又經濟的方法。根據種子的貯存特性可將種子分為正常性(orthodox)
和頑拗性(recalcitrant)種子。此外還有一類種子介於正常種子和頑拗性種子之間,最典
型的如咖啡種子,耐乾燥但不耐低溫(不能貯於10℃以下)。頑拗性種子主要包括熱帶(可可
、椰子)和亞熱帶植物及水生植物種子(水浮蓮、菱、茭白)和溫帶植物(板栗、櫟樹),這類
種子脫離母體時不經成熟脫水期,其含水量相對較高且對脫水及低溫敏感,因此不耐儲藏,
壽命短。如可可在10℃或低於10℃時死亡,芒果在3～6℃亦會受到損害,含水量降低到12%
～31%之間就會使芒果種子生活力迅速下降,甚至全部死亡。對漆樹科的芒果、樺木科的歐
洲榛子、柿樹科的柿、山毛櫸科的板栗、栓皮櫟和黑櫟等、金絲桃科的鳳果、胡桃科的美
國山核桃、核桃、樟科的油梨、桑科的菠蘿蜜、棕櫚科的可可椰子、油椰子、薔薇科的枇
杷、芸香科的酸橙、檸檬和甜橙、無患子科的龍眼、梧桐科的可可等果樹的種質保存期進
行了研究,其結果是,保存期最長者可達5年,最短者只有20?,絕大多數種子保存期為一個月
。由於頑拗性種子相互之間差異性很大,即使同一物種不同的變種也不一樣,因此需要逐個
研究。至今頑拗性種子的保存已取得了階段性的成果。Hor等將可可種子於17～30℃下保
濕貯存可將壽命自20?延長至70?;將可可種子用殺菌劑處理貯於聚乙烯袋中24周後,還有
50%以上的發芽力。?hin等將紅毛丹種子貯於濕活性炭或鋸屑中,可以延長髮芽力達1個月
。?anson將紅毛丹種子在塑料袋中保濕貯藏2個月之久。王曉峰等將芒果種子用電扇吹風
使含水量達到51 0%時,用塑料袋密封,於15℃下貯藏,種子的壽命由室溫空氣中的8?延長至
7個月,還有65%發芽率。唐林鳳等將木菠蘿種子先進行部分脫水,使種皮趨於風乾狀態後,
置於能適度換氣的塑料袋中,在15℃下濕藏,由自然條件下的1個多月延長至815?仍可保持
90%的發芽率。
2.2 花粉保存花粉的目的在於:?、授粉,在不同花期或授粉不良時使用;?、育種,解決花
期不同的矛盾,而且可以隨時進行雜交授粉;?、基因保存,花粉具有半套基因,穩定且體積
小;?、便於運輸。大多數花粉在0℃左右到-20℃的低溫下,以及空氣相對濕度在10%至30%
之間,低氧濃度或高二氧化碳濃度甚至無氧條件下,有利於長期保存。最近科學家們認為採
用20℃/min的快速降溫配合快速解凍可以使花粉在超低溫下保存活性,對溫度較敏感的植
物來說,這是有希望的方法。科學家們用冷凍乾燥法保存溫帶果樹的桃和梨的花粉達10年
之久[14],熱帶果樹油梨的花粉,在液氧與0%相對濕度條件下保存1年後,仍能授粉成功。
2.3 枝條和根對於遺傳物質複雜的果樹,用枝條保存比種子或花粉貯藏有許多優越性,因
為它能繁殖成遺傳型穩定的材料,通常要求低溫或-2～2℃,並保持相對濕度96%～98%,不使
營養體乾燥失水。目前溫帶果樹如蘋果、葡萄、柿、李的枝條可保存1年以上,梨經過2年
-10℃的貯存其嫁接成活率和新采的接穗並無顯著差異。然而落葉果樹接穗一年至少有7個
月可從樹體獲得,所以,一般情況下,貯存接穗的必要性很小。利用液態氮來貯存果樹枝條
其結果則難以預料。蘋果葉芽相當耐寒,不需要使用抗凍劑可直接置入液氮中,但在放入之
前須緩慢降溫到-40℃,凍融後用於嫁接,成活率達80%,生長良好。而對於熱帶的常綠果樹
則不同,採樣季節、部位以及貯存溫度等因素都要特別慎重,如處理恰當,還有成功的希望
。根的貯存對於不需要嫁接的樹種或砧木,如石榴、棗樹等,利用的可行性高。
2.4 細胞、組織或器官利用組織培養技術保存種質資源具有佔用空間小、可免遭自然狀
態下病蟲為害等優點。材料可採用原生質體、未分化的細胞與愈傷組織分化的芽和胚等。
但最理想的是莖尖和分生組織,因為它們不但在遺傳或形態上較細胞或其它部位穩定,且一
般不受病蟲侵染,最大優點是再生容易,對於那些屬於頑拗性種子的果樹,利用莖尖培養更
有特殊價值。保存方式最好利用冷凍保存(-196℃液氮),這種保存方法不但能使其生長速
度停止而且不用繼代培養,又能減少植物體突變的機會而達到基因穩定的目的。目前在莖
尖及分生組織方面的研究已獲成功。運用這些方法,可可、柑桔和香蕉的保存效果最佳,其
次為葡萄和油椰子等,最後為麵包果。組織培養保存在果樹種質的繁殖和貯藏上很有前途,
但有兩個可預見性缺點。一個是從組培小苗要經過長時間才能長成一株開花結果的樹,另
一個是比田間定植增加損失的危險。因此組織培養可作為田間定植的一種補充方法。
3 不同溫度下的保存
3.1 低溫保存即利用低溫對植物生命活動有抑製作用而進行的保存。所用的溫度一般為1
～10℃。保存耐冰凍植物的種質常採用此方法,但對於冷敏感植物則不宜採用。
3.2 超低溫保存超低溫保存是指在-80℃以下的超低溫中81保存種質資源的一整套生物學
技術。在超低溫條件下保存材料,可以大大減慢、甚至終止代謝和衰老過程,保持生物材料
的穩定性。超低溫常用乾冰(-79℃)、深冷冰箱、液氮(-196℃)及液氮蒸汽相(-140℃)獲
得。由於冷源通常選用液氮,因此超低溫保存又稱液氮保存或??(-196℃)保存[7]。保存的
材料有原生質體、懸浮細胞、愈傷組織、體細胞胚、胚、花粉胚、花粉、花藥、莖尖分生
組織、芽、莖段等。但較大的材料如莖頭、胚或試管苗,由於高度液泡化的細胞易受到嚴
重傷害,解凍後只有分生細胞能夠重新生長。幼小的球形胚比老齡胚存活率高。成熟胚或
是完全不能恢復生機,或是需要特殊處理。超低溫保存的一般程序是:無菌組織培養和細胞
懸浮培養;加入冰凍保護劑;以適當速度冷卻或經預處理之後置於液氮中;培養物在液氮中
貯藏;解凍;反覆沖洗,除去冰凍保護劑;檢定生活力;對恢復活力的培養物再培養;誘導生長
並再生植株。影響植物種質超低溫保存效果的因素很多,其中某個環節處理不當,就可能影
響整個系統的成功,影響存活率。
3.2.1 預培養 是指在添加高滲物質或冰凍保護劑的培養基中培養。已有試驗證明蘋果
莖尖生長點在含冰凍保護劑的培養基中預培養4?,對提高存活無效應。
3.2.2 冰凍保護劑 冰凍保護劑可以降低冰點和水的過飽和點,提高玻璃化消失點;增強
溶液粘性,阻止凍晶生長,使之較易達到玻璃化狀態;促進結冰早期各階段進行保護性脫水
。最常用的冰凍保護劑是????和甘油,已經證明????是最有效的冰凍保護劑。?lric和
?inkle等利用10%????+8%葡萄糖+10%???的復合保護劑,使棗椰樹愈傷組織的存活率接近
100%。
3.2.3 冰凍 細胞傷害主要發生在冰凍過程中。為了防止凍害,必須防止內冰晶的形成。
不同的植物材料對凍害的敏感程度不一樣,因此,降溫的方法也不一樣。常用的降溫方法有
:慢凍法。樣品以0 1～10℃/?in(1～2℃/?in最常用)的速度將溫度降至-30～-40℃或-100
℃,平衡一段時間後再轉入液氮。這種方式對懸浮細胞和原生質體比較適合。?artha發現,
草莓生長點的降溫速度必須嚴格控制在0 5～1 0℃/?in範圍內,否則存活率明顯下降。快
凍法。將樣品直接放入液氮或其蒸汽相中冷凍和貯存,溫度下降的速度為300～1000℃/?in
。在這樣快的降溫速度下,貯存物很快跨越冰晶形成區,-140℃以下冰晶不再增生,細胞內
呈「玻璃化」狀態。此法可保存含水量較少的植物材料,如花粉和種子以及高度脫水的抗
寒植物的枝條等。分具冷凍法。又可分為先慢後快和先快後慢兩種。前一種方法更為常用
,它結合了慢凍法和快凍法兩者的優點。起先的慢凍逐漸使細胞失水達到保護性的脫水,形
成高濃度的溶質,以防止第二步快凍時受損傷。
3.2.4 解凍 解凍必須迅速,很多實驗表明,冰凍過的植物組織培養物在35～40℃水浴中
解凍比在室溫(25±2)℃下解凍效果好。但有些研究結果與此並不一致。冰凍後的組織和
細胞很脆弱,解凍時應避免劇烈搖動。解凍後的樣品應置於冰浴中,以防止高溫下冰凍保護
劑的毒害。在35～40℃水浴中解凍時應防止過熱傷害,待凍融後即可取出。近幾年來,人們
對幾十種頑拗性種子超低溫保存,發現效果並不好,僅可可幼胚、椰子胚經處理後產生了幼
苗[22],其餘如黃皮等只保持生根、分化愈傷組織的能力。超低溫保存種質用液態氮作冷
源,液氮罐就是冷凍器和貯存容器,除了每隔40～60?補充1次液氮外,不需機械空調設備及
其它管理措施,免去了檢測活力和繁殖更新等繁雜程序,從而節約了人力物力。但也存在涉
及的試驗材料面窄,長期連續使用凍存材料的再生能力衰退,組織培養後代遺傳穩定性仍未
解決(莖尖生長點有可能解決這一問題)等問題。
摘自《福建果樹》2002.2
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