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其中被廣泛用在植物的系統就是組織培養，可以不同的培植體方式進行種原的儲存(如：
種
子、花粉、孢子、DNA…等)，而所得到的培植體大致上配合以下重點方式，來進行種原保
存：
減緩生長(slow growth method)：
控制溫度約1~4℃
減少光照
低氧環境
控制荷爾蒙含量：succinic acid 2,2-dimethyl hydrazide(B-9), cycocel(CCC) 和
abscisic acid(ABA)均能有效減緩生長
添加滲透壓抑制劑(osmotic inhibitor)：3~6%的mannitol或高濃度的sucrose添加入培養
基中，可減緩生長
超低溫保存技術(cryopreservation)：
˙將貯藏溫度降至-20℃以下，可稱為低溫貯藏；在此溫度下，種子的貯藏多須密封在容
器內，除非是貯藏設備已極為完善，達到能自動調節濕度並能長時間保持恆溫及恆濕，則
種子不須密封於容器內。所謂的極低溫貯藏是將種子貯藏在液態氮溫度 (約-196℃)或更
低的溫度，甚至於在絕對溫度下貯存，而仍能保持其發芽能力，最主要的是他們能耐嚴重
脫水或極端的抗寒，但是潮濕種子經常會因輕度冷凍而死亡，除非他們能在寒冷氣候中越
冬；種子的含水量在15%以下，即使在極端低溫(約-271℃)種子也不會受到損害；而在正
常脫水狀態下，植物細胞浸到液態氮中，只要降溫後再回暖的速度控制得宜，還是能夠成
活；有關此種降低溫到液態氮溫度仍能成活的因素到目前為止仍不是很清楚。
˙用液態氮的極低溫處理且能獲致最高的種子發芽率的程序應為：
1先將種子乾燥至含水量為乾重基礎的8-15 %.
2.將種子封入鋁箔袋或放入螺旋蓋密閉的鋁製或塑膠製的容器內。
3.把盛有種子的鋁箔袋或容器從室溫浸入液態氮內貯藏﹒
4.貯藏後，欲使用時，把鋁箔袋或容器取出，回溫至0℃或室溫條件下慢慢回溫。
以下分別介紹之：
A. 種子型種原保存
◎種子庫
˙步驟如下：
1.利用Seed collecting nets或是利用直升機收集瓦勒邁杉的種子
Seed collecting nets
Seed collecting with a helicopter
2.將種子乾燥，使其水分含量降至5~8 % of dry weight ，減少水分含量(低溼度)可以使
呼吸作用變慢，減緩老化，延長活性
3.種子置入貯藏庫中，進行低溫種原保存。其儲存溫度的控制因素有二：適合的冷凍櫃造
價及期望的種子壽命。極低溫
或許允許種子生存好幾個世紀，但在大多數的例子中，因價格太高而被排除，大多數
種子的貯藏溫度在-10℃至-20℃之間，但有些種類可以高至-5℃。使用較簡單的系統，
省下來的經費可以用來研究異儲型(recalcitrant)的種子─那些不能以簡單方法保存的種
子。
[補充]
˙長期貯藏庫的溫度是攝氏零下12±2度，相對溼度是30±3％。在這環境下，種子壽命可
達30?50年，貯藏容量24萬份，種原須經嚴格鑑定及評估才能入庫永續保存。
˙中期貯藏庫的溫度是攝氏 1±2度，相對溼度是40±3％，貯藏容量25萬份。這貯藏庫貯
藏常用種原，供交換、繁殖與評估之用。
˙短期貯藏庫的溫度是攝氏10±2度，相對溼度是40±3％，專供貯藏經常取用的種原，如
育種材料的親本或後裔，以及具有特殊性狀的研究材料。這貯藏庫也供國內科學家申請寄
存他們的研究材料。
4.以貯藏庫方式運送至世界各地
B. 非種子型種原保存
◎花粉庫或孢子庫
˙使用花粉或孢子來保存種原的優點：
1.花粉粒子甚小，數千個或上萬個的花粉粒可貯存在一個很小的容器內。
2.能很容易得到最大的歧異度。
3.花粉可用於育種學，尤其是人工授粉時，更是不可或缺的。此常用於親代花期不同或不
同地區雜交時，均須使用貯藏花粉。
4.植物如有自花不授粉的，異花的開花期又不一致；則可將花粉貯存，俟其他的花開後，
再進行授粉。
˙使用花粉或孢子來保存種原的缺點：
1.花粉或孢子的貯藏期比種子短，最長的花粉貯藏期不過數年而已，目前已知貯藏最久的
花粉為蘋果的花粉，在-20℃下貯藏可達9年之久。
˙步驟如下：
由新鮮的花取得花粉或孢子
乾燥花粉或孢子。控制濕度：在空氣中相對濕度低，對花粉存活力有益，一般言之，相對
濕度為10-30%時，花粉的存活力能保持得最久;如更低，則會影嚮花粉的類脂酸自動氧化
，而減弱活力，一些存活期特別短的花粉，如禾本科的植物即使是在輕度乾燥也不能忍受
;如玉黍蜀的花粉在相對濕度50%以下便逐漸失去活力。
控制溫度：貯藏溫度低對花粉的活力保存有正面的影響，可利用極低溫貯藏
(cryopreservation)，如：置於液態氮(-196℃)
通入二氧化碳：大氣中的氧氣由於能促使氧化作用的進行，因而對花粉的貯藏不利，反之
，二氧化碳常能阻止氧化作用的進行，對花粉的貯存有利。
避免光照：將花粉暴露於陽光下，不利於花粉的貯藏，尤其是紫外線及放射線對花粉的活
力影嚮尤其大。
◎染色體DNA庫
生物技術，可能在未來幾年之後將大大改變基因庫的本質，為最具保存種原多樣性潛
力的方式。以DNA 片段為保存體，可以被重組或放大做為植物育種之用。目前這些生物技
術能成功地直接應用於保存種原的例子相當的少，一方面限於成本過於昂貴，另一方面則
必需對物種的發育機制與遺傳結構有更深入的瞭解，才能期望利用這些技術來保存種原之
多樣性。
◆【問題二】請運用組織培養方法，增加瓦勒邁杉的基因變異，並選出可以種在寒帶的杉
苗？
Ans：
A.利用 誘變育種 (induced mutation breeding) 方式增加基因變異：
˙誘變育種為產生遺傳變異及重要基因選殖之良好工具，其目的主要為：提高產量、改進
產品質量、產生新的生物活性物質。整個誘變育種的基本過程為：植株 → 誘變 → 初篩
→ 複篩 → 放大 → 獲得優良變異株。其中又以誘變（induced mutation）和篩選（
screening）為最重要的兩個環節。在誘變育種過程中，有幾個原則須注意：
1.誘變劑的選擇：簡便有效
2.誘變劑的種類：物理誘變劑，化學誘變劑，擬輻射物質（radiomemetic chemical
）
3.誘變劑量的選擇：存活率或死亡率曲線，劑量-誘變率曲線
˙誘變方法：
1.物理因素：利用放射線照射誘發突變，如γ射線、鈷六十
2.化學因素：化學誘變劑 (如秋水仙素、硫酸二乙酯 、乙烯亞胺、羥胺等化學藥劑)，誘
發遺傳物質產生突變，而可加以利用。
˙所得誘變物種的利用：
(1) 直接法: 誘發突變後，直接加以固定作為品種利用，一般多為既有之優良品種誘得優
良性狀後加以利用。
(2) 間接法: 誘變結果多伴有惡劣因子，故多以突變體為雜交材料，以育成優良品種。
˙由於誘變可獲得大量之變異，若以植株選拔，需要大面積土地及勞力。若使用細胞培養
選拔，可於小規模之室內進行試驗。(除細胞外，癒傷組織、花藥、原生質體都可誘發突
變)
但有下列問題需待解決：
1.若要選拔隱性突變因子，須以單倍體培養。
2.需尋找及建立單細胞分離、原生質培養及單細胞再分化為植株的有效方法。
3.由於須在細胞階段選拔，故須找出在細胞培養即可選拔之性狀。
利用以上誘變方法得到的突變細胞，分化成植株，進行耐寒試驗，最後再轉入田間，進行
田間試驗，通過有性世代使遺傳性穩定下來，最後獲得耐寒性的杉苗。
B.利用體細胞雜交(somatic hybridization)方式增加基因變異：
利用與瓦勒邁杉親源相近的耐寒物種(如：智利南洋杉，其為南洋杉屬中唯一耐寒的樹
種，可耐－17℃ 的低溫，而且又與瓦勒邁杉同科，較不易出現雜交不和合的現象)，與瓦
勒邁杉進行原生質體融合，藉由加入適當fusogen (如：sodium nitrate，polyethylene
glycol)，接受外來遺傳物質，包括DNA片段、粒線體、葉綠體，甚至細胞核等，以達到基
因轉移目的，得到somatic hybrid，使轉移進來的基因於再生植株中表現，在進行耐寒性
試驗，篩選出耐寒性的杉苗，最後再進行田間試驗。
˙步驟如下：
1.分別取出瓦勒邁杉以及智利南洋杉之花粉
2.分別取得花粉原生質體：將花藥切開→取出花粉→置於在含有酵素和滲透壓穩定劑的溶
液中→培育→原生質體沉到培養皿底部→除去酵素溶液→將原生質體移入CPW清洗→離心
→清洗基質兩次→重新懸浮於培養基→除去小的個體，用血球計計數→調整到合適的密度
重懸浮於培養基。
3.進行原生質體融合：利用PEG法(Polyethylene glycol)，分別取在含有13％甘露醇的
CPW上懸浮培養的原生質體（密度2×105）4mL，混和在100g的轉速下離心10mins，將原生
質體放入0.5％基質→加入30％（w/v）PEG 2mL，使原生質體的外膜不穩定，放置10min→
每隔5min加入原生質體培養基稀釋PEG以促進原生質體融合。每次稀釋後輕微搖動原生質
體就會重懸浮→混和物在100g下離心10min，離心後在不含PEG的培養基中清洗→離心，在
相同的培養基上重懸浮
4.將融合之原生質體接種到適當的選擇性低溫培養基，進行耐寒性篩選，選擇出具有抗寒
性的原生質體，進行原生質體培養。
5.增殖分化生成抗寒性瓦勒邁杉植株幼苗
C.利用基因轉植方式增加基因變異：
1. 將耐寒性基因 (如：北極魚的耐寒基因、阿拉伯芥中分離 glycerol-3-phosphate
acyltransferase 基因)利用以下基因轉殖方法，移入瓦勒邁杉的基因體上
◎直接轉殖 (Direct DNA delivery)
1. 微量注射法 (Microinjection)
2. 電穿孔法 (Electroporation)
3. PEG-mediated gene transfer
4. 基因槍法 (Microprojectile bombardment, Gene gun)
5. 花粉管法 (Pollen tube pathway)
◎非直接轉殖
1. 農桿菌法 (Agrobacterium-mediated transformation)
2. 病毒法 (Virus vector)
2. 利用抗寒性試驗，篩選出成功將耐寒基因轉殖到瓦勒邁杉中的細胞。
3.大量培養、誘導分化生成植株，
4.進行田間試驗，獲得遺傳性穩定的耐寒植株。
◆【問題三】在利用組織培養使其幼胚發展根系的初步試驗，發現添加IAA的效果不佳。
請討論效果不佳的可能原因為何？如何解決？
Ans：
目前已知Auxin對莖及葉柄的延長有助益，但是也有可能抑制根的生長；而這種促進
或抑制的作用受到五種因素的影響：
1.組織或是器官的生長階段
2. Auxin的濃度
3. Auxin的種類，天然或是合成的
4.與其他荷爾蒙之間的作用
5.組織為切除下來的或是在活體內的。
以下分別討論之：
組織或是器官的生長階段
胚在整個發育過程中，會經歷不同的生長階段(stage I → stage II→ stage III)，在
不同的發育階段，胚所需要的營養成分組成以及含量都會有所不同(如附註)，因此IAA效
果不佳的原因，可能是因為當時胚所處的生長階段，並不需要IAA，故添加IAA反而導致根
系發展受到抑制。
解決方法：
正確的了解胚所處的發育生長階段，添加適合他的培養基成分。
Auxin的濃度
一般來說，生長素(IAA)對營養器官縱向生長有明顯的促進作用。如芽、莖、根三種
器官，隨著濃度升高，器官伸長遞增至最大值，此時生長素濃度為最適濃度，超過最適濃
度，器官的伸長則受到抑制。
不同器官的最適濃度不同，莖端最高，芽次之，根最低。由次可知，根對IAA（生長
素）最敏感，極低的濃度就可促進根生長，最適濃度為10-10M。莖對IAA敏感程度比根低
，最適濃度為10-５M。芽的敏感程度處於莖與根之間，最適濃度約為10-８M。所以能促進
主莖生長的濃度往往對側芽和根生長有抑制作用。
正由於根對IAA的敏感度最高，因此對於根系的發展，IAA的濃度便顯得很重要，如同
上點所述，組織或器官在不同的發育生長期時，所適合的最適濃度都不一樣，因此加入
IAA效果不佳的原因，可能是因為當時所需的IAA濃度不對所造成
解決方法：
正確的了解胚所處的發育生長階段，添加適當濃度的IAA。
Auxin的種類，天然或是合成的
IAA由於是植物天然活性成分，故很不穩定，容易見光而分解，因而造成IAA效果不佳。
解決方法：
1.使用人工合成、性狀較穩定的NAA，利用NAA製成”生根粉”。 但NAA具有一定的特
異性，即僅對具有NAA轉化酶的植物起作用。
2.使用市售廣效型生根粉，例：ABT系列生根粉。
3.加入活性碳於培養基中。
與其他荷爾蒙之間的作用
IAA與其他荷爾蒙之間會有相互的影響作用，如下
˙[IAA] = [CK] (細胞分裂素)→生長，細胞不分裂
[IAA] > [CK] → 根生長
[IAA] < [CK] → 莖生長
˙ABA和IAA以及Gibberellin拮抗
可能是因為IAA濃度小於或等於cytokinin，使根的生長受到抑制；或是植物處在逆境時，
使植物體產生過多ABA，用以拮抗IAA的作用，使得IAA的效果不彰
解決方法：
控制其他荷爾蒙的量，讓他們和生長素之間的作用達到促進根生長的平衡
組織為切除下來的或是在活體內的
基本上，在活體中，生物體正常的生理反應機制能有效的發揮IAA的效用；但若因為組織
培養所切除下的培植體(本題為embryo)，其不具有系統的機制來進行荷爾蒙的調控，因此
使得在培養時，常會出現一些recalcitrance的現象，造成IAA對培植體的效果不彰。(?不
確定?)
解決方法：
確實了解引起recalcitrance的因素，並且加以改善
◎其他可能原因：
˙培養操作過程：
1.氧濃度太低。例：
降低濃度促進胡蘿蔔癒傷組織芽的形成，增加氧濃度促進不定根形成。
乾長根，濕長芽。
˙根和胚芽鞘的生長所要求的含氧量不同。根的生長，包括細胞的伸長和擴大，及細胞分
裂，而細胞分裂需要有氧呼吸提供能量和重要的中間產物。因而水多、氧不足時，根的生
長受到抑制。但是胚芽鞘的生長，主要是細胞的伸長與擴大，在水層中，水分供應充足，
故而芽生長較快。
˙與生長素含量有關。在水少供氧充足時，IAA氧化酶活性升高，使IAA含量降低，以至胚
芽鞘細胞伸長和擴大受抑制，根生長受影響小。而在有水層的條件下，氧氣少，IAA氧化
酶活性降低，IAA含量升高，從而促進胚芽鞘細胞的伸長，並且IAA運輸到根部，因根對
IAA比較敏感，使根的生長受到抑制。
解決方法：
增加氧濃度。
2. 培養基中營養不足或有毒代謝物的積累。
解決方法：
(1)定期subculture到新鮮的培養基上。
(2)加入活性碳吸附有毒物質。
˙外在環境
光線波長不恰當或過亮。
例：藍光有利於芽的分化，而紅光、遠紅光對芽分化有抑制作用，但促進根分化，紫光
對生芽有刺激作用。
解決方法：
調整成促進生根的光線 (紅光、遠紅光)。
加入活性碳至培養基中。
2. 培養溫度過低或過高。
解決方法：
調整至適合根系生長的溫度。例：胡瓜的根系生長適溫是22-25℃。
研究控制基因表現的分子機制
˙步驟如下：
利用已知的基因序列定出上游的control sequences(包括enhancer和silencer)以及
promoter
把包含control sequences、promoter以及該基因序列選殖出來，insert到特定plasmid
( plasmid I ) 的multiple cloning site
轉殖到competent cell，觀察該酵素表現的情形
將上述表現型研究所獲得的特定成分的基因序列定出，並選殖出來，insert到特定的
plasmid ( plasmid II )
將plasmid I和plasmid II同時轉殖到competent cell，另以一組同時轉殖plasmid I和不
含 insert 的plasmid II當作對照組
以PCR檢測各組酵素表現的情形，從酵素表現的異同，判斷該特定成分對於基因的調控作
用
進一步了解訊息傳遞
可將該特定物質打入細胞，觀察該物質加入後時間對該酵素表現的情形，若在此物質
打入細胞的初始，酵素立即大量表現，則此物質可能是直接影響該酵素的表現；但若此物
質打入後，並未立即發生酵素表現，經過一段時間才表現，那此物質可能是間接影響酵素
的表現，中間可能經過一聯串的梯瀑反應(cascade)。這其中可能是protein-protein
interaction所進行的複雜調控機制，詳細的調控可能需要更進一步的複雜研究技術。
【補充—認識瓦勒邁杉】
瓦勒邁杉的葉片化石就像其他植物化石一樣，可依據葉脈、氣孔、細胞等特徵，判斷
屬於南洋杉科的裸子植物，至於和哪些現生種類相近，則有待更多其他部分的化石被發現
。
Fossil of Wollemi Pine Mature foliage
1994年9月10日，大衛諾柏在瓦勒邁國家公園（Wollemi National Park）（雪梨西北
方藍山山脈）健行，當他走到一處陡峭的岩壁時，突發奇想利用攀岩垂降到這個岩壁的谷
底，意外發現一些外貌奇特的古老樹群；身為野外工作者，大衛很自然地收集了一些枝條
與葉子，帶回去請求鑑定。該中心及雪梨皇家植物園（Royal Botanic Garden, Sydney）
研究人員再度前往該地採集了更多的樣本，經過詳細比對及鑑定，除了發現這種植物其實
已經有化石的紀錄（且僅僅有化石的紀錄）外，並依據葉子形態、葉脈及毬果等特徵判斷
，該種植物應歸類在現生植物中的南洋杉科（Araucariaceae）。
原本現存的南洋杉科植物有兩個屬—貝殼杉屬（Agathis）及南洋杉屬（Araucaria）
，而此種植物特徵明顯可以和此二屬區別，所以必須成立一個新屬。當各種資料都顯示此
一物種為新分類群時，1995年由三位學者依發現的地點給與「屬」的命名，並以發現此植
物「大衛諾柏」先生的「姓」作為本植物的「種小名」。拉丁化以後，本物種的正式學名
即為—Wollemia nobilis W.G. Jones, K.D. Hill & J.M. Allen，英文名稱是Wollemi
Pine；而為了國人方便稱呼，音譯為瓦勒邁杉。
瓦勒邁杉是一常綠大喬木，樹幹直立，在環境不佳時會由基部長出許多分枝；樹皮棕
褐色，有許多小瘤狀突起。嫩葉淺綠色，對生排列平面生長，隨著葉片的成熟，除了顏色
加深變暗外，更會轉成立體排列，同時枝條也開始分岔成二列 。瓦勒邁杉是雌雄同株異
花，往往是雄花先開了以後雌花才形成；雄花一般位置較低，呈圓棒狀；雌花子彈形著生
於枝條末端，呈淺綠色。雌花授粉後漸漸膨大，果鱗隨之變長，且顏色漸轉深呈暗綠。據
悉，一枚毬果由授粉後到成熟開裂，至少需要2至3年。
Male Cone Micro propagation
經在苗圃實驗後，發現瓦勒邁杉的繁殖除了可經由種子發芽繁殖外，組織培養的瓶苗
也很容易生長，扦插的植株更能培養出各類型的苗木；加上野外研究調查的資料及苗圃育
苗的資訊，發現影響瓦勒邁杉生長的速率主要是陽光及土壤，在陽光充足及酸性的土壤中
，幼株可以一年50公分、成株則是150公分的速率生長。瓦勒邁杉對溫度的「耐性」更是
驚人，在零下5至40攝氏度間都還可以存活，但是生長速率及一些形態卻會隨之調整，例
如改變葉子的顏色或停止生長，這也是為什麼在野外雖然還有瓦勒邁杉的族群（約100株
），但是經過數百年的生長，最高者也才40公尺左右！因為這裡每天只有十分之一的陽光
照得進來，換句話說即使在夏天白日較長，照射時間也不到1.5小時；而有些植株因為環
境實在惡劣，竟然可以停止生長達100年之久！
為了要保育瓦勒邁杉這片森林，澳洲政府幾乎完全封鎖該地區，不過由於培育有成，
將於今年至明年間對國際全面開放，屆時除了推廣這種可以長在戶外庭院、室內植栽、地
被灌叢、盆景裝飾等多用途的植物，所得經費更可進一步做為瓦勒邁杉，及其他稀有瀕危
物種的相關研究及保育工作。
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After black clouds, clear weather.
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