http://72.14.235.104/search?q=cache:BHm335weXd4J:www.ce.mit.edu.tw/bioeng7/91%E7%94%9F%E5%8C%96%E5%85%A8%E6%96%87%255C26.doc+mrs+glucose&hl=zh-TW&gl=tw&ct=clnk&cd=14&lr=lang_zh-TW
本研究挑選不同種類的醱酵蔬菜之乳酸菌含菌量、菌種鑑定。經隨機採樣8件市售醱酵蔬
菜(泡菜5件、酸筍1件及酸菜1件)，以含有CaCO3之GYP培養基進行乳酸菌分離，結果顯示
泡菜食品含菌量大於酸菜及酸筍食品。從分離菌相中挑選303個分離菌落，進行鑑定菌種
及針對耐酸性及耐膽鹽性等條件，挑出86株耐受性較佳的分離菌落進行腸道吸附能力
(adhesion in Caco-2 cell)試驗；同時以含prebiotic物質果寡糖之MRS agar培養基檢測
，篩選出125個菌落可醱酵prebiotics物質果寡糖，並以細胞生長密度及HPLC分析確認。
根據probiotics特性及prebiotics特性，找出數株具synbiotics特性的乳酸菌分離菌落。
關鍵字：乳酸菌、probiotics、prebiotics、synbiotics。
1.前言
自古即有利用調節腸內共生菌以延長壽命之說，而直到近十年來全球相關含活的
probiotics 產品才驟增。由於抗生素雖可治療胃腸疾病，但對內生性益菌同時造成傷害
且有副作用的疑 慮，故 probiotics 被考慮用來取代抗生素的作用，以期食品補給
probiotics 的方式達到”醫食同源”之目的。對於益菌生長具促進功效的 prebiotics
亦廣泛地被單獨販售或複合方式添加至上述之 probiotics 製品中。攝取 probiotics 及
prebiotics 均能達到有益宿主健康之功效，兼具 probiotics及prebiotics之特色時，
即為synbiotics[1]。本研究挑選不同種類的醱酵蔬菜(泡菜、酸筍及酸菜)，以含有CaCO3
之GYP培養基進行乳酸菌分離並鑑定菌種。將此些分離菌株，針對耐酸性(pH2-pH3)、耐膽
鹽性(0%、0.2%、0.3%及0.4% bile slats)、腸道吸附能力(adhesion in Caco-2 cell)等
probiotic特性，依不同測試條件進行篩選；同時以含prebiotic物質之MRS agar培養基檢
測，從醱酵蔬菜分離之乳酸菌是否可醱酵prebiotic物質，並以細胞生長密度及HPLC分析
確認。
2.材料與方法
2.1材料
泡菜(A, B, C, D, E品牌)、酸菜及酸筍等醱酵蔬菜購自台北市超商及傳統市場。
2.2乳酸醱酵食品所含乳酸菌之篩選及菌種鑑定方法
將樣品進行連續稀釋，以Plate Count Agar (PCA)及含有CaCO3的Glucose- Yeast
extract- Peptone (GYP) medium進行分析並篩選挑出分離菌株。參考乳酸菌實驗colony
分離及鑑定[2]及Microbiology Experiments:A Health Science Perspective[3]等方法
所述，分別進行Gram 染色、鏡檢法、Endospore stain、Catalase測試、糖類發酵試驗、
產氣試驗、生長溫度測試、耐鹽性測試。依據以上各種菌種鑑定可將乳酸菌種細分成不同
亞屬，將細分的菌屬以API (analytical profile index) System (bioM’erieux
Vitek, Inc.)進行乳酸菌種鑑定。
2.3抗酸性試驗[4]
乳酸菌菌液經隔夜培養，調整最適細胞密度為OD 600nm至0.6~0.7，取1.5 ml菌液離心10
分鐘，並以磷酸鹽緩衝溶液(PBS, pH 7.4 )清洗菌體一次，加入0.6 ml PBS溶解。取其中
0.5ml，分別加入不同pH值( pH2.0、3.0 )之4.5ml磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中。樣品與緩衝
液充分混合後，以37℃、80rpm培養之，3小時後立刻取出1 ml混合液進行連續稀釋，以
MRS agar在37℃下培養48小時，計算存活之乳酸菌菌數並以對數值表示之。此外，另取乳
酸菌菌液1 ml進行連續稀釋，計算未處理的乳酸菌菌數，做為0小時之原始菌數對照。
2.4抗膽鹽試驗[4]
乳酸菌菌液經隔夜培養，調整最適細胞密度為OD 600nm至0.6~0.7，取1.5 ml菌液離心10
分鐘，並以磷酸鹽緩衝溶液(PBS, pH 7.4 )清洗菌體一次，加入0.6 ml PBS溶解。取其中
100μl接種至10ml之MRS broth及含有0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v) oxgall之
MRS broth中，置於37℃下培養，並於培養期間之0、3、6、9、12小時取出200μl菌液，
置於96微孔培養盤，讀取OD600nm之吸光值。最後計算乳酸菌在兩種培養基中之生長速率
，以求得膽鹽耐受力。
2.5吸附性試驗[5]
將培養3週之Caco2-cell細胞以PBS緩衝液清洗，加入MEM培養30分鐘後， 接種測試菌株，
於37 ℃培養1小時，再以PBS緩衝液清洗，加入methanol固定細胞，後以Gram染色，在顯
微鏡油鏡下觀察。吸附菌量之計算如下：在20個random fields中，若細菌量低於40時，
表示非吸附。在20個random fields中，若細菌量介於41-100間，表示有吸附。在20個
random fields中，若細菌量大於100時，表示強烈吸附。
2.6 Prebiotic特性分析[6]
加入2％（wt/vol）純的果寡糖(FOS)、0.05％L-cysteine、1.5%agar、30mg bromcresol
purple至basal MRS agar，製備MRS-FOS agar medium進行分析，將菌落生長在無醣MRS
broth中再稀釋至約生長25-50菌落之倍率，並塗佈在MRS-FOS agar plate。經厭氧環境下
培養24小時。可醱酵FOS之菌落，會在菌落周圍產生之黃色區帶不可醱酵FOS之菌落，不會
在菌落周圍產生之黃色區帶且菌落呈現白色。將可醱酵FOS之菌株進行生長密度分析及利
用利用HPLC分析生長曲線中各點prebiotics moiety 濃度。在此使用JASCO Hypersil
APS2 column (250 × 4.6mm, 5μ)、RI-410 detector。管柱以異丙酮：水＝3：1為移動
相、流速1ml /min。
3.結果與討論
3.1乳酸菌菌量與菌種鑑定
經隨機採集5件市售泡菜（A、B、C、D、E品牌），以PCA培養基檢測生菌數及GYP medium
檢測乳酸菌含量，結果顯示泡菜食品含菌量(達105/ ml以上)大於酸菜及酸筍食品(如表一
)。從GYP medium中挑選303株乳酸菌菌落，針對此303株菌，進行Gram染色、鏡檢法、
Endospore、Catalase測試、糖類發酵測試、產氣測試、生長溫度測試、及耐鹽性測試等
菌種鑑定，再由API system test確認鑑定結果，發現含有Lactobacillus fermentum、
Lactobacillus casei、Lactobacillus acidophilus、Lactococcus plantarum、
Lactococcus lactis。
3.2 Probiotics特性分析
根據GYP medium中挑選303株乳酸菌菌株，進行酸處理及膽鹽處理試驗，根據低pH(pH 2.0
或pH 3.0)及高濃度膽鹽(0.3%(w/v)、0.4%％(w/v) oxgall)結果，挑選出86株耐受性較好
的乳酸菌分離株進行吸附性試驗，結果顯示數株乳酸
菌分離菌落可吸附在Caco-2 cell上(如圖一)。
3.3 Prebiotics特性分析
利用添加果寡糖之MRS培養基進行醱酵果寡糖乳酸菌之試驗，結果顯示在303株乳酸菌分離
株有125個乳酸菌菌落可醱酵果寡糖。而此303個菌落均可在basal MRS medium中產生菌落
，只有其中125個菌落可醱酵FOS 產生足夠的酸造成明顯的顏色改變。為了確認是依據FOS
之利用，將菌株培養至不含糖、含2% glucose、含2%純FOS的MRS medium中進行確認。結
果，FOS醱酵菌株Lactococcus sp.F38及Lactobacillus sp. V57(如圖二)的細胞生長密度
比FOS非醱酵菌株Lactobacillus GG高，最終細胞生長密度約為1.5倍。利用HPLC分析醱酵
液中FOS含量，將可醱酵菌株及非醱酵菌株培養至一定濃度之GF2、GF3、GF4 moiety。結
果在FOS醱酵菌株Lactobacillus casei F38，確實可消耗FOS compound的GF2、GF3、GF4
moiety；而非醱酵菌Lactobacillus GG，就很少減少這些糖（如圖三）。
4.結論
根據probiotics特性分析及prebiotics特性分析，篩選出數株兼具probiotics及
prebiotics特性乳酸菌分離菌落具有synbiotics特性(如表二所示)。
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