http://www.yaofen.com/fxjsread.asp?id=1536
隨著科學技術的進步，對液相色譜技術的要求也不斷提高，單從技術角度的改進已經不行
。這就需要同時從科學與技術的角度出發，或者說從理論高度對液相色譜重新認識。因此
，UPLC（超高效液相色譜）概念得以提出，將HPLC的極限作為自己的起點。
在1996年，Waters公司推出Alliance HPLC時的主要目標是提高液相色譜的「精
度」。當時多數公司都認為HPLC技術已經發展到極致了、而同時用戶對性能沒有更高的需
求，因此HPLC的目標應該是降低成本、走向更低的價格以獲得更廣泛的應用。針對這樣的
觀念，Waters公司提出：HPLC的技術沒有到達極限，用戶對HPLC有更高的要求，HPLC精度
的提高對更好、更可靠的結果有極大的益處，對法規的遵從也是一個極大的促進。
站在當今世界科技前沿的液相色譜用戶現在又有了新的需求；首先是改進生產力
的需求，因為大量的樣品需要在很短的時間內完成，例如代謝組學分析；其次是在生化樣
品及天然產物樣品的分析中，樣品的複雜性對分離能力提出了更高的要求；第三是在與MS
及MS/MS等檢測技術聯用時，對連接的質量提出了更高的要求。簡而言之，我們需要「更
快地得到更好的結果」
今天我們發現，隨著科學技術的進步，對液相色譜技術的要求也不斷提高，單從
技術角度的改進已經不行。這就需要同時從科學與技術的角度出發，或者說從理論高度對
液相色譜重新認識。因此UPLC（超高效液相色譜）概念的提出也就十分自然；簡單的說：
UPLC是用HPLC的極限作為自己的起點。
理論基礎
早在1956年，J.J van Deemter就發表了他著名的理論：van Deemter曲線及其方
程式。最早這個理論是用在氣相色譜上的，但是後來出現的液相色譜上也能應用這個理論
。Waters公司引入UPLC的概念就是由研究這個著名的方程式開始。
首先探討一下這個著名的方程式。如果只關心柱效（H）與流速（線速度；u）及
填料顆粒度（dp）之間的關係，就可以把該方程式作如下的簡化：
其中：A項代表了顆粒度和柱床填裝的優良程度；B項代表了軸向擴散；而C項則
代表了傳質。從不同顆粒度的曲線中我們可以看到如下圖所示的現象：
首先顆粒度越小柱效越高；其次每個顆粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速；最後
，更小的顆粒度使最高柱效點向更高流速（線速度）方向移動，而且有更寬的線速度範圍
。所以降低顆粒度不但提高柱效，同時也提高速度。使用更高的流速會受到色譜柱填料耐
壓及儀器耐壓的限制。反之；如果不用到最佳流速，小顆粒度填料的高柱效就無法體現。
另外，更高的柱效需要更小的系統體積（死體積）、更快的檢測速度等一系列條件的支持
，否則小顆粒度填料的高柱效同樣無法充分體現。
因此，要真正創建一個全新的分離科學領域 －UPLC，必須解決幾個問題：
* 大幅提高色譜柱的性能；第一要解決小顆粒填料的耐壓問題，第二要解決小顆粒填
料的裝填問題，包括顆粒度的分佈以及色譜柱的結構。
* 高壓溶劑輸送單元（超過15,000psi）。
* 完善的系統整體性設計，降低整個系統的體積，特別是死體積。並解決超高壓下
的耐壓及滲漏問題。
* 快速自動進樣器，降低進樣的交叉污染。
* 高速檢測器；優化流動池以解決高速檢測及擴散問題。
* 系統控制及數據管理，解決高速數據的採集、儀器的控制問題。
新型色譜填料及裝填技術
UPLC?分離只有在新型的、耐壓而且顆粒度分佈範圍很窄的1.7?m顆粒填料合成出
來之後才有可能。
色譜柱技術應該涵蓋幾個方面的內容：首先是填料的合成，以得到高質量的填料
顆粒，包括：耐高壓、耐酸鹼等等。其次是顆粒的篩選，選出顆粒度分佈盡可能窄的填料
。最後是裝填技術，以保證即堵住顆粒不使其外流，又不至於引起反壓的大幅升高。
Waters公司利用1999年發明的雜化顆粒技術（Hybrid Particle Technology －
HPT；美國專利號：No. 6,686,035 B2），合成了第二代有機硅填料。它使用雙（三乙氧
基硅）乙烷在硅膠中形成橋式乙基基團。
這樣合成出來填料在其內部有了更多的「交聯」結構，其機械強度有了極為顯著的提
高，耐壓超過了20,000psi。使用這項技術，Waters公司合成了低於2?m顆粒度的填料 －
1.7?m顆粒度的「AcQuity UPLC」填料。為了得到更好的耐壓能力及傳質作用，還優化了
該填料的孔體積及孔徑。
傳統色譜柱填料的裝填技術受兩個方面的影響，導致現有小顆粒填料色譜柱的性
能及質量均不能令人滿意。首先是其顆粒度分佈一般較寬，例如，5?m顆粒度填料中會有
大量的4?m以下及6?m以上的顆粒，因此通常使用2?m篩板在色譜柱的出口攔截填料，阻止
其外漏。其次；如果使用低於2?m的篩板，篩板的反壓升高很快，甚至超過了填料所產生
的反壓。因此；目前大多數3.5?m、2.5?m或更低顆粒度的填料還是使用2?m的篩板，只是
在柱頭裝填一小段5?m的填料。因此現有小顆粒度填料的色譜柱與理論或理想狀態相距甚
遠。
Waters公司的AcQuity UPLC使用了更嚴格的篩分技術使1.7?m填料的分佈很窄，
並且使用了全新篩板（專利申請中）及其他色譜柱硬件（柱管及其連接件），在超過
20000psi的壓力下裝填。Waters公司為此安裝了一條新的色譜柱裝填生產線及新的測試設
備。因此；AcQuity UPLC色譜柱的性能及質量有了質的飛躍。
填料的合成技術、顆粒的篩分技術、篩板及色譜柱硬件技術的提高，在更高的壓
力下裝填色譜柱是UPLC色譜柱性能、質量保證的關鍵。
超高壓液相色譜泵
Waters公司具備製造超高壓泵的能力，UNC的Groove教授所用的超高壓液相色譜
泵是Waters公司為其特別製造的。除了密封、高壓動力之外，超高壓色譜泵主要解決的問
題是超高壓下溶劑的壓縮性及絕熱升溫（Adiabatic Heating）。
AcQuity UPLC裝備一台獨立柱塞驅動、四個溶劑切換的兩元高壓梯度泵，其
1ml/min流速時的耐壓可達15000psi，具有精確、可靠的梯度性能。新型的超高壓輸液泵
使獨特的小顆粒填料技術可以在最優化的流速下工作，以充分發揮其特點。集成改進的真
空脫氣技術，使四個流動相溶劑及兩個進樣器洗針溶劑同時得到良好的脫氣。
其梯度的重現性也非常好，如下圖所示，儘管保留時間在1min以內，其重現性卻
與HPLC的重現性不相上下。
自動進樣器
為了降低死體積、減少交叉污染，自動進樣器的設計使用了許多新技術，例如針
內針樣品探頭（XYZZ』）、壓力輔助進樣等等。所謂「針內針」的XYZZ』設計，實際上就
是使用液相色譜管路（PEEK材料）充當進樣針以減少死體積，而「外針」是一小段硬管，
用來扎破樣品瓶蓋。
壓力輔助進樣在如此小的儀器的系統體積下保證可靠、重現的進樣是非常重要的
措施。為了降低交叉污染，採用了一強、一弱的雙溶劑的進樣針清洗步驟，這兩個脫氣溶
劑也採取了脫氣措施。
高速檢測器
然而，在新的色譜柱技術支持下的高壓、高速UPLC對AcQuity UPLC結果的檢測提
出了挑戰。首先是速度問題，在短時間內出現如此多的色譜峰需要更快的數據採集速率相
適應，至少要在10Hz以上，還需要降低樣品檢測池內的駐留時間。當然同普通的HPLC檢測
器一樣，信噪比也是新型檢測器的追求目標。
儘管因需要降低擴散而不得不使用很小體積的檢測池（<1?L），但是仍然要設法
提高光能量通過及傳輸來降低噪音。同時必須使用更快的採樣速率、非常小的時間常數值
，以適應UPLC所產生的非常窄的色譜峰，見下面的不同採樣速率的色譜圖。AcQuity UPLC
使用新型光纖引導、Teflon AF池壁的流動池；10mm的光程（與普通HPLC相同）而體積只
有500nL（普通HPLC的20分之一）。光束通過光纖完全引入流動池後，利用Teflon AF的特
徵在池壁內全折射，不損失光能量；同時採樣速率達到40點/s。
這樣設計的高速檢測器不但適應了UPLC?高速及高分辨率的特徵，而且還對UPLC?
靈敏度的提高有很大的幫助。
優化系統綜合性能的設計
Waters? ACQUITY Ultra Performance LC?系統的整體設計優化了超低系統體積
及死體積，使之能獲得成功的UPLC?所必須的低擴散、高速檢測所帶來的所有優點，同時
還可以充分利用質譜電噴霧離子化接口的優點。由於這個原因，ACQUITY UPLC?系統會是
理想的質譜接口。
當連接了我們的質譜技術時，ACQUITY UPLC?系統的解決方案可以提供更靈敏的
LC/MS及LC/MS/MS分析。例如；當與Micromass? LCT Premier?連接時，數據的質量與速度
有了驚人的改進。
應用
由於超高效液相色譜（UPLC）是一個新興的領域，Waters的ACQUITY UPLC?系統
也是剛剛出現，因此目前已發表的應用資料還很缺乏。與傳統的HPLC相比，UPLC的速度、
靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。因此首先想到的UPLC應用是代謝組學分
析及其他一些生化領域。其他目前能夠想到的應用領域還包括天然產物的分析。使用UPLC
與Tof或Q-Tof等質譜檢測器連接，會對天然產物分析，特別是中藥研究領域的發展是一個
極大的促進。
多數生化樣品及天然產物都十分複雜，能被分離的色譜峰再多也會覺得不夠。下
面這張圖是多肽指紋圖的HPLC與UPLC兩個色譜圖（紫外檢測）比較。在同樣條件下，UPLC
能分離的色譜峰比HPLC多出一倍還多，因此我們有可能進一步研究：保持分離度而追求更
快的分析速度，在相同時間內作更多的樣品，或優化分離度在同樣時間內再分出更多的色
譜峰。
下面這張圖是代謝產物分析的色譜圖。在同樣條件下；UPLC的分辨率使我們認出
更多的色譜峰（質譜檢測器 － LCT）。
在提到「蛋白組學」或「代謝組學」時，與沒有「組」的差別從分析的角度說就
是樣品量極大，需要在短時間分析成千上萬的樣品。UPLC不損失分離度的高速度優點在這
裡就能充分體現。
本文作者系Waters公司
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 124.8.146.71