http://72.14.235.104/search?q=cache:s3PHX32-atUJ:www.ce.mit.edu.tw/bioeng7/91%E7%94%9F%E5%8C%96%E5%85%A8%E6%96%87%255C172.doc+bromocresol+purple&hl=zh-TW&gl=tw&ct=clnk&cd=25
乳酸菌可以產生乳酸, 降低腸道中之PH而達到抑制腸內腐敗菌及致病菌之生長, 同時它
亦可能產生多種抗菌物質可以殺死腸道中之壞菌, 在現代忙碌生活裡對我們的胃腸扮演著
重要的角色. 世界各國有關乳酸菌的相關產品相當多, 如A菌, B菌, C菌 , 微胞保護乳酸
菌, 孢子型乳酸菌等, 上市產品又有優酪乳, 乳酸菌粉等健康食品 .
為對乳酸菌的研究作進一步的探討, 本研究計畫進行孢子型乳酸菌之篩選與發酵培
養;以菌種之耐酸性,溫度穩定性, 貯存安定性, 抑菌性及加工穩定性等特性為篩選時之判
斷標準, 期望能透過此一標準而篩選出一株具優良特性之孢子型乳酸菌出來. 除此之外,
我們亦將以工業界的考量進行高菌量培養, 深入探討其發酵條件, 利用分批進料法尋求高
菌量培養.
關鍵詞：乳酸菌、孢子型乳酸菌
1. 前言
乳酸菌通常是泛指能夠發酵碳水化合物，以產生乳酸為主要產物之微生物，乳酸菌在
多數動物消化道中為優勢菌，細胞較大，通常以成隻或成串出現；少數具有芽胞，能在很
廣圍的溫度(15℃~45℃)中生長。其具有抑制腸道中有害微生物的生長，調節及建立腸道
內菌相外，其還具有治療腸內不適所引起之腹瀉，降低血中膽固醇，並且改善乳糖不耐症
以及抑制致癌因子及癌細胞等等療效，就因乳酸菌具有這些優點的存在，因而乳酸菌至今
才會被世界各地延用多年。
雖然在市面上利用乳酸菌所製造出的產品十分眾多，例如優酪乳(統一AB優酪乳，光
泉晶球優酪乳…等) ，優格，起司，乳酪，表飛鳴，泡菜…等等相關的產品。但在這些產
品之中能夠真正在人體中發生其作用的乳酸菌之菌種十分的少，其主要原因乃是人體的胃
酸值介於PH值2~3之間，而使得許多乳酸菌種根本無法在此低PH值之下生存，根據許多文
獻中記載中孢子本身具有高度的耐酸性，耐高溫性，及高度貯存安定性，所以我們將考慮
孢子型乳酸菌的探討，但乳酸菌中會產生孢子的菌種卻十分的少見，目前文獻上的孢子型
乳酸菌有Sporolactobacillus、Bacillus laevolacticus、Bacillus racemilacticus、
Bacillus coagulans 被應用於益生菌，且具有很好之保健效果。
由於Bacillus coagulans 已被廣泛地應用於腸胃疾病，安全性較無問題，且其在好
氧環境生長快速。因此我們將篩選此菌株，對其特性、高菌量發酵培養及產孢性作一詳細
研究，以建立一套可以量產化的商業化製程，未來期望能進一步轉移給業界進行量產。
2. 實驗方法
2.1菌種篩選與鑑定
動物糞便中分離出多株菌種，將菌體倒入液態培養基（如表一、二），培養24hr，37
℃。將菌液移至45 ℃培養箱培養48hr，使其產孢。產孢菌液以90 ℃，30min隔水加熱，
使其未產孢的菌種死亡。以連續稀釋10-2, 10-3後取0.1mL的稀釋菌液培養24hr 37 ℃，
以求得單一菌落，再以劃線法求得更純的菌株，並以顯微鏡觀察。利用革蘭氏染色、顯微
鏡觀察、作catalase測定、作oxidase測定初步判定是否為凝結芽孢桿菌 ，再以 Biolog
鑑定系統做進一步鑑定。
2.2 5升發酵槽發酵分析
利用控制攪拌速率達到合適的溶氧量，利用發酵溫度、發酵時間、分批進料
法等，尋求高菌量培養。
2.3菌種的生長條件與營養需求分析
不同溫度下的生長性－我們分別考慮25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、,50℃、55℃
、60℃發酵槽發酵培養。
不同碳源培養基之篩選－我們將分別改變Glucose，Sucrose，fructose，glycerol及
starch，以探討不同碳源的影響。
2.4尋求凝結芽孢桿菌最佳產孢溫度
我們將考慮在35℃~60℃間，尋求一較適的產孢溫度。分別考慮不同的溫度35℃、40
℃、45℃、50℃、55℃、60℃培養使其產孢，我們將以眼視與顯微鏡觀察未產孢與產菌的
差異。
2.5孢子對於溫度及PH耐受性之測試
孢子菌對於不同溫度的耐受性測試：
將產孢的菌液分別取1mL後，各經80℃、85℃、90℃、95℃隔水加熱30分鐘、60分鐘、90
分鐘，後取1mL使用連續稀釋法，稀釋後取1mL接於BCP上，放於37℃培養48小時後計算菌
數。
孢子菌對於不同pH值的耐受性測試：
將產孢的菌液分別取1mL放入pH2、pH3、pH4之液態培養液以37℃培養後30分鐘取菌液分別
取1mL接於BCP上，放於37℃培養48小時後計算菌數。
3. 結果與討論
3.1菌種篩選與鑑定
目前我們已篩選得一株 Bacillus coagulans 其鑑定特徵如表三，進一步委託食品研
究所作Biolog 系統鑑定。
3.2菌種的生長條件與營養需求分析
生長溫度測試：在不同之溫度下，我們共測試了25℃， 30℃， 35℃， 40℃，45℃
，50℃，55℃，60℃。 等八種不同成長溫度。實驗結果如圖一所示，由圖中可知，30℃
以下，以及45℃以上菌體成長均不甚理想，50℃以上，菌體成長則完全停滯。溫度在
35~45℃之間，菌體之成長情況差異不大，由此可知本株菌是屬中溫菌屬，未來應用在人
體，動物之保健用途上甚為適合。
碳源之篩選，本研究共測試了包括Glucose，Sucrose，fructose，glycerol及
starch。等多種不同碳源，經測試結果以sucrose，glucose，starch可達較佳之成長，
但與其他碳源之比較其優勢並不很明顯〈圖二〉，因此可以推論本菌株對碳源需求並不具
特異性，這可能歸因於此株菌屬野生型，又營養需求較為寬鬆。
最佳產孢條件，為獲得較好之產孢率，本研究亦針對產孢溫度進行篩選比較，由圖三
可知，菌體培養溫度要在45℃以上，才開始進行產孢。低於40℃
以下產孢情況非常差，產孢速率亦很慢，而在55℃以上，菌體在未產孢前到大量死亡，產
孢率亦不佳。在45~50℃應為最佳狀況。若配合糖濃度之偵測，可以發現在45℃時，耗糖
速率加快，在8~12小時內，發酵液中之糖濃度會降至零。這可能是造成在此溫度範圍內,
產孢率較佳的原因。
孢子對pH耐受性測試，由於保健用乳酸菌需通過胃酸之嚴苛挑戰，才能順利到達腸道
。因此乳酸菌對酸性條件之耐受性是一個非常重要的特性。由圖四可知，本株菌在pH3以
上，耐受兩小時其菌體存活率幾乎不受影響。在PH2時，一小時內，菌體存活率仍在90%以
上，2小時以上存活率降為80%左右。因此本株菌在商業使用上，應較一般市面上所販售之
乳酸菌製品，具有更佳之耐酸性。
孢子對溫度之耐受性測試，在加工過程中，乳酸菌製通常會接觸到高溫條件，尤其是
粉末或錠劑製品均需由高溫加以乾燥，因此對高溫度之耐受度是乳酸菌製品另一個非常重
要的特性。由圖五結果可知，既使溫度在90℃以上，30分鐘內，菌體存活率仍不受影響。
1小時以上，生菌數才會下降，這個結果亦較一般之乳酸菌為佳。綜合以上結果可知，即
使溫度在90℃以上，30分鐘內，菌體存活力仍不受影響。1小時以上，生菌數才會下降，
這個結果亦較一般之乳酸菌為佳。綜合以上結果可知，我們篩選到之乳酸菌的確具有較佳
的耐酸性，抗溫性及加工穩定性，未來應用在商業化生產上應有很大之潛力。
4. 結論
目前已篩得菌株Bacillus coagulans，並已用5L發酵槽發酵得OD值達到10(菌數大約
為5*109隻/c.c)，已達商業化生產標準。接下來將利用多次進料進行高菌量培養及用100L
發酵槽進行試量產試驗。
5. 謝誌
感謝國科會（NSC 89-2214-E-218-003）計畫的經費補助
6. 參考文獻
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15.廖啟成.乳酸菌之分類及應用.食品工業.1998.
表一. 固態培養基(BCP) 表二. 液態培養基
Glucose 1g/L Glucose 0-15 g/L
酵母萃取物 3g/L Peptone 0-7.5 g/L
Bromocresol purple 0.04g/L 酵母萃取物 0-4.5
g/L
L-Cystein 0.2g/L Maltose extract 0-4.5
g/L
Peptone 5g/L PH=6.8
Agar 15g/L
Tween80 1㏄/L
PH=7.0
表三. 凝結芽孢桿菌鑑定特徵
特徵 反應
細胞形態 桿狀細胞
芽孢形狀 卵圓或球形
厭氧生長 _
色素 +
革蘭氏染色 +
最高生長溫度 60℃
Catalase活性 +
Oxidase活性 _
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