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目的要求
瞭解多糖提取和純化的一般方法。
實驗原理
多糖類物質是除蛋白質和核酸之外的又一類重要的生物大分子。早在60年代，人們就發現
多糖複雜的生物活性和功能。它可以調節免疫功能，促進蛋白質和核酸的生物合成，調節
細胞的生長，提高生物體的免疫力，具有抗腫瘤、抗瘍和抗愛滋病(AIDS)等功效。
由於高等真菌多糖主要是細胞壁多糖，多糖組分主要存在於其形成的小纖維網狀結構交織
的基質中，利用多糖溶於水而不溶於醇等有機溶劑的特點，通常採用熱水浸提後用酒精沉
澱的方法，對多糖進行提取。影響多糖提取率的因素很多，如：浸提溫度、時間、加水量
以及脫除雜質的方法等都會影響多糖的得率。
多糖的純化，就是將存在於粗多糖中的雜質去除而獲得單一的多糖組分。一般是先脫除非
多糖組分，再對多糖組分進行分級。常用的去除多糖中蛋白質的方法有：Sevag法、三氟
三氯乙烷法、三氯醋酸法，這些方法的原理是使多糖不沉澱而使蛋白質沉澱，其中Sevag
方法脫蛋白效果較好，它是用氯仿：戊醇或丁醇，以4：1比例混合，加到樣品中振搖，使
樣品中的蛋白質變性成不溶狀態，用離心法除去。
本實驗採用Sevag法(氯仿：正丁醇＝4：1混合搖勻)進行脫蛋白，用DEAE Sepharose層析
柱進行純化，然後合併多糖高峰部分，濃縮後透析，凍干，得多糖級分。
試劑和器材
一、試劑
平衡緩衝溶液：0.01mol/L Tris-HCL, PH=7.2。
洗脫液：A: 0.1mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2; B: 0.5mol NaCl, 0.01 mol
Tris-HCl PH=7.2。
氯仿、正丁醇、乙醇(95％)等，均為分析純。
二、材料
灰樹花子實體。
三、
器材
DEAE Sepharose Fast Flow，旋轉真空蒸發儀，搖床，離心機，層析柱：26×10。
操作方法
一、粗多糖的提取
將多糖子實體切碎烘乾後稱量，採用熱水浸提法，每次原料和水之比均為1：5，浸提溫度
為70℃－80℃，浸提時間3－5h，共提取4次，合併4次浸提液。真空旋轉蒸發濃縮，濃縮
一倍體積。對多糖提取液需進行脫色處理，即以1％的比例加入活性炭，攪拌均勻15min後
過濾即可。在濃縮液中加入3倍體積的乙醇攪拌，沉澱為多糖和蛋白質的混合物，此為粗
多糖。 它只是一種多糖的混合物，其中可能存在中性多糖、酸性多糖、單糖、低聚糖、
蛋白質和無機鹽，必須進一步分離純化。
二、粗多糖的純化
粗多糖溶液加入Sevag試劑(氯仿：正丁醇＝3：1混合搖勻)後，置恆溫振蕩器中震盪過夜
，使蛋白質充分沉澱，離心(3000r／min)分離，去除蛋白質。然後濃縮，透析，加入4倍
體積的乙醇沉澱多糖，將沉澱凍干。
取樣品0.1g溶於10ml 0.01mol/L Tris-HCL, PH=7.2的平衡緩衝液中。上樣，用Buffer
A: 0.1mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2; Buffer B: 0.5mol NaCl, 0.01 mol
Tris-HCl PH=7.2 進行線性洗脫，分部收集。各管用硫酸苯酚法檢測多糖。合併多糖高峰
部分，濃縮後透析，凍干，即得多糖級分。
第二部分多糖的鑒定
目的要求
（1）瞭解薄層層析法分析單糖組分的原理和方法。
（2）瞭解紅外光譜法鑒定多糖的原理和方法。
實驗原理
採用薄層層析法分析單糖組分。薄層層析顯色後，比較多糖水解所得單糖斑點的顏色和Rf
值與不同單糖標樣參考斑點的顏色和Rf值，確定樣品多糖的單糖組分。
多糖的分析鑒定一般借助於氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、紅外光譜(IR)和紫外光
譜(UV)等技術，氣相(液相)色譜—質譜(GC／HPLC—MS)聯用技術成為分析多糖更為有效的
手段。
本實驗利用紅外光譜對多糖進行鑒定。多糖類物質的官能團在紅外譜圖上表現為相應的特
徵吸收峰，我們可以根據其特徵吸收來鑒定糖類物質。0—H的吸收峰在3650—3590cm－1
，C—H的I申縮振動的吸收峰在2962—2853cm－1，C＝O的振動峰為1510—1670－1之間的
吸收峰，C—H的彎曲振動吸收峰為1485—1445cm－1，毗喃環結構的C—0的吸收峰為
1090cm－1。
試劑和器材
一、試劑
濃硫酸，氫氧化鋇。
展開劑:正丁醇：乙酸乙酯：異丙醇：醋酸：乙醇：水：?啶＝7：20：12：7：6：6。
顯色劑:1，3－二羥基?硫酸溶液（0.2％1，3－二羥基?乙醇溶液）：濃硫酸＝1：0.04（
V/V）。
單糖標準品。
二、器材
沸水浴, 玻璃板，傅裡葉變換紅外光譜。
操作方法
一、單糖組分分析
1．薄層板制備：稱取硅膠5g於50ml燒杯中，加入用 12 mL 0.3mol／L 磷酸二氫鈉水溶，
用玻璃棒慢慢攪拌至硅膠分散均勻，鋪在玻璃板上(7．5cm×10cm)，110℃活化1h。即置
有乾燥劑的乾燥箱中備用。
2．點樣：稱取少許的多糖(0．1克)於2．0mL離心管中，加入1M的硫酸1mL，沸水浴水解2h
，然後加氫氧化鋇中和至中性，過濾除去硫酸鋇沉澱，得多糖水解澄清液。以此水解液和
單糖標準品進行點樣進行薄層層析展開。用點樣器點樣於薄層板上，一般為圓點，點樣基
線距底邊2.0cm，點樣直徑為2—4mm，點間距離約為1.5—2.0cm，點間距離可視斑點擴散
情況以不影響檢出為宜。點樣時必須注意勿損傷薄層表面。
3．展開：展開室如需預先用展開劑飽和，將點好樣品的薄層板放入展開室的展開劑中，
浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.5—1.0cm（切勿將樣點浸入展開劑中），密封室蓋，
等展開至規定距離（一般為10—15cm），取出薄層板，晾乾。
4．顯色：將展開涼干後的薄板再在100℃烘箱內烘烤30分鐘，將顯色劑均勻地噴灑在薄板
上，此板在110℃下烘烤10分鐘即可顯色。
薄層顯色後，將樣品圖譜與標準樣圖譜進行比較，參考斑點顏色、相對位置及Rf值，確定
樣品中有哪幾種糖。
二、紅外光譜在多糖分析上的應用
將凍干後的樣品用KBr壓片，在4000～400cm-1區間內進行紅外光譜掃瞄，有如下的多糖特
徵吸收峰：3401 cm-1（O-H），2919 cm-1(C-H), 1381 cm-1及1076 cm-1（C-O）。在
900 cm-1處的吸收峰說明該多糖以β-糖?鍵連接。在N－H變角振動區1650-1550cm-1處有
明顯的蛋白質吸收峰，表明該樣品是多糖蛋白質複合物。
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