→ jgex2as:真的很對不起現在才po 晚上電腦一連線就停住不動 04/13 23:26
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※ 引述《deathscytheX (° ▽ °|||)》之銘言：
※ 引述《kohigh (keep thinking)》之銘言：
1.自動化鑑定不符合手工法(ex: catalase,gram stain )時如何進一步鑑定？不符合的原
因為何？
<ANS>若鑑定結果不合，可能需要重挑菌落或再做subculture的動作然後確實將菌液調至
適當濃渡再上機一次。reagent也要檢查看看是否過期或品質不良。但是事實上細菌室的
做法是如果手工法已經做到有把握，那自動化鑑定的結果只會當參考依據。畢竟電腦data
base有限，而且人腦比較靈活。至於不合的原因可能有以下幾點：
1.沒挑到single colony或挑錯colony 2.菌液濃度不對3.試劑過期或品質出問題
4.電腦data base不足5.細菌是活的，生命總是充滿奇蹟6.人為疏失……等等。
2.如何鑑定NFGNB
<ANS>都是GNB，且TSI管皆為K/K。以下為常見或實習時較有印象的菌之鑑定
Oxidase(+)： Pseudomonas aeruginosa 在MH plate 上為草綠色，BP上灰扁黏
具有水果香
Shewanella putrefaciens 產H2S，TSI管黑
Oxidase(-)：
Lactose(+)：Acinetobacter baumannii colony較大，EMB上呈粉紅色
Lactose(-)：Stenotrophomonas maltophilia ，會利用maltose，可加種一管maltose(黃)
3.何為ESBL?
<ANS>ESBL (Extended Spectrumβ-lactamase)這類細菌能水解更多cephalosporin類抗生
素主要有E.coli，K.pneumonia，K.oxytoca，P.aeruginosa……等等。
cefotaxime,ceftazidime分別及與clavulanic acid合併測試；若合併測試的抑制圈比各別
測試大5 mm以上，即表示是製造ESBLs的細菌。遇到這樣的細菌要小心，因為它們的抗藥性
比傳統細菌強。
4.如何偵測TB？
<ANS>
1.可種L-J agar 並觀查cord factor
2.生化反應niacin(+)；nitrate迳nitrite
3.種MGIT並利用BD的Bactec960判讀結果。長菌生成CO2加強MGIT管螢光反應
4.作acid-fast stain 或auramine-rhodamine 螢光染色
5.HPLC
6.PCR ex: COBAS AMPLICOR? Analyzer 全自動PCR
7. Strand Displacement Amplification (SDA) ex: Becton-Dickinson產品
8.Probe hybridization ex: Genprobe的RNA hybridization
9.LCR( ligase chain reaction) ex: Abbot產品
10.PCR-RFLP
11.western blot 或ELISA測抗體
12.Lateral flow technology 利用標Dig或Biotin之primer pairs 作出含Dig及Biotin之
target sequence。流經streptavidin 標定之gold最後呈色於anti Dig Ab之line。
5.分離鑑定Prevotella 及 Fusobacterium
<Ans>
Prevotella Fusobacterium
kanamycin R S
螢光 紅 綠
染色型態 Fusiform，pleimorphism
6.舉出三種在腹瀉時用來分離腸內菌的培養基，敘述其設計及欲分離之目標
<Ans> a.HE AGAR：分離Salmonella 及 Shigella
發酵lactose使pH indicator(bromothymol blue) 呈黃色。含iron
salt 可測是否產H2S。Bile salt可抑制大部分的雜菌生長。
b.TCBS：分離Vibrio
thiosulfate 和 citrate使medium呈鹼性，bile and cholate抑制
雜菌，vibrio會代謝產酸呈黃色colony
c.Campy-BAP：分離Campylobacter
含sheep blood、vancomycin抑覺 Gram(+),trimethoprim(廣效性),
cephalothin (抑制 streptococci)
7.試述分子檢驗方法及原理
<Ans>
PCR：Sepicific的primer夾出target
Nested PCR：兩對primer，第一次的product做為template再amplify，增加
專一性。
Multiplex PCR：用兩對以上的primer，可同時放大多個基因片段
Real-time PCR：用螢光的probe 即時偵測PCR的產量
(今天珮珊seminar講的molecular beacon、Taqman )
RFLP：restriction fragment length polymorphism
SSCP：single strand conformation polymorphism
ssDNA folding的特殊結構只要有一個base的改變即會不同，利用
SDS-PAGE可敏銳的將conformation有差異的分子分離
PFGE：Pulsed Field Electrophoresis，通過電場的不斷改變，使DNA分子
的泳動方向做相應改變，小的DNA分子比大的變形快，故小分子泳動
得快，在gel上呈現出電泳帶型，可以用於大分子DNA的分離。
Probe hybridization 、 Microarray
DNA sequencing
8.Campylobacter spp.在臨床上的重要性為何？如何鑑定？
<Ans> 常見的細菌性腸胃感染原。引起腹瀉、血便、腸胃炎、fever、
septicemia等症狀。因表面抗原跟神經細胞的Ag相似，可能併發GBS等自
體免疫疾病。
Gram(-)bacilli,菌體彎曲。為microaerophilic 在5%O2 10% CO2 42度C
CAMPY BAP 培養兩天以上。Colony 為灰色黏狀，Oxidase(+)。
細菌室做hipurate hydrolysis(+)發C.jejuni,(-)發C.coli
9.如何利用kanamycin(1mg),vancomycin(5μg)，colistin(10μg)來幫助厭氧菌的鑑定
？
GPB：VA(S)，CL(R)，KA(V)
全部R：Bacteroides fragilis group
VA(R)，其他(S)：Fusobacterium，B. ureolyticus，B. gracilis，Campylobacter，
Veillonella，Bilophila wadsworthia
Porphyromonas和Prevotella：Pro的VA(S)，Pre的VA(R)
10.請敘述Bacteroides bile esculin(BBE)和Kanamycin-vancomycin-laked blood(KVLB)
培養基的特性
BBE：Bacteroides fragilis group
有加gentamycin和oxgall會抑制facultative anaerobe和大部分G(-)。
Bacteroides fragilis group會將agar中的esculin水解產生esculetin，
esculetin和agar中的ferric ion反應在colony周圍產生黑色沈澱。
KVLB：Bacteroides、Prevotella
是selective medium for anaerobe，且可抑制Proteus的swarming。有加
vancomycin會抑制G(+)生長。Laked blood是經過冷凍解凍使RBC lyse，可以促
進一些厭氧菌生長，而且也利於觀察會產生pigment的細菌
11.請詳細敘述Candida albicans 之Germ tube測定方法，如何觀測及判讀
1. yeast用rabbit serum或human serum調成suspension，另一支不加serum當control
2.種到EMB agar上，放到35℃培養4小時
3.鏡檢，如果yeast有伸出觸手(請畫圖)就是Candida albicans，control則不會
12.請敘述傳統方法自stool中分離Salmonella和Shigella之培養基及鑑定方法
1.種SS agar和HE agar
SS agar(淡紅色)：
˙bile and dye：抑制G(+)生長
˙lactose and inhibitor：若細菌會使用lactose發酵則有紅色colony，不會則為
無色colony，∴Salmonella和Shigella會是無色colony
˙ferric citrate and thiosulfate：若H2S(+)則會有黑色中心之colony。部分
Salmonella是H2S(+)，因此有黑色中心之colony要挑
HE agar(綠色透明)：
˙含lactose、sucrose、salicin以及Bromthymol blue：會分解三種醣類的就會產
生黃色colony，∴Salmonella和Shigella會是綠色colony
˙bile salt：抑制其他腸內菌
˙ferric ammonium citrate and thiosulfate：若H2S(+)則會有黑色中心之
colony。部分Salmonella是H2S(+)，因此有黑色中心之colony要挑
※現在細菌室不用SS agar，改用EMB代替
2.從HE agar上挑綠色colony和中心黑色的綠色colony，種TSI、SIM、Lysine
Shigella：K/A，motility(-)，其他幾乎沒反應s
Slamonella：K/A(g)，motility(+)，indole(-)，Lysine(+)
TSI indole Lysine
Slamonella K/A(g), H2S - +
S. typhi K/A, H2S(weak) - +
S. paratyphi K/A(g) - -
3. Typing
Salmonella：O antigen，Vi antigen，H antigen
Poly一定要positive才是Salmonella
Shigella：O antigen，Ornithine
13.敘述TSI, VP test and citrate 的原理與判讀法
<Ans>
TSI:trisuger iron agar
一種斜面固體培養基，內有lactose, sucrose and glucose(10:10:1)
可以同時看利用醣類,產生H2S和產氣的情形。
當結果是黃色，代表有利用醣類(可以用lactose and sucrose)進而產生酸，
而紅色就代表沒有利用醣類；若是黑色，就代表有產生H2S。
VP test:Vogas-Prokauer test
用來測細菌是否會產生glycol and Butanediol(兩個Acetoil合成)
產生acetoil代表細菌利用glucose的時候，最後並不是進入TCA cycle，
而是產生其他的產物。
加入creatine, KOH and naphthol時，若為紅色，則視為positive
citrate test
可以用來測試細菌是否可以直接運送citrate進入當作碳源，進入TCA cycle利用
若是呈藍色，代表basic，就是可以直接利用citrate，視為positive
14.Str的鑑定流程與方法
GPC─catalase(-)→Str or Enterococcus
GBS: CAMP(+)
enterococcus: Bile-esculin and 6.5%NaCl (+)
Str. pneumoniae: optochin (S) bacitracin (R)
others: grouping
catalase test: bac + catalase → 起泡泡 視為positive
CAMP test: 利用S. aureus與目標菌種種在BP(T型),若是隔天有箭頭!!!視為CAMP(+)
Bile-esculin:將菌種在Bile-esculin，隔天有長且有黑色，視為positive
6.5%NaCl:將菌種在6.5%NaCl，隔天有長，視為positive
grouping:利用其antigen對應的antibody作grouping
15.台大常見的NFGNB的兩隻菌，如何鑑定
Ps. a
AB
GNB→TSI(K/K)─oxidase→(+)─Arginine(+) 42度(+)→Ps. a(蘋果綠+水果香)
(-)─glocose (+) maltose (-)→AB
16. Sta的鑑定流程與方法
GPC─catalase(+)→coagulase (+) S. aureus →OX(R):MRSA, 可能有雙重溶血圈
(-) CNS
17.細菌室如何偵測TB感染?(請以傳統法及分生法說明)
Ans: 傳統法
一.Acid-fast Stain
(1)先用NaOH處理:因為Mycobacteria細胞壁厚抗酸可藉此去除痰內其他雜菌
(2)用Mucolytic agents(溶痰劑)處理:含Na-L-cysteine,可殺死其他雜菌.
而mucolytic agents則可讓痰液變的較不黏,方便下步離心的動作.
(3)染Acid-fast Stain
二.Culture
使用Lowenstein-Jensen media,6-8星期後觀看是否有長菌
分生法
一.Sero-diagnosis
抽血看是否有TB的Ab(為了快速診斷)
二.DNA diagnosis
(1)16s rDNA sequencing (使用Roche儀器)
(2)IS6110(Insertion sequence)
18.如何對Listeria monocytogenes做鑑定?(5%)
Ans: 不產孢子,catalase (+) esculin(+) ,β溶血(narrow like GBS)
unbrella-shaped motility (25度c) ,4度c會生長 tumbling test
CAMP test (with S.aureus 火材棒狀)
19.台大醫院細菌室如何鑑定 S.pneumoniae 對penicillin是否有
抗藥性?你認為此法正確嗎?還有其他方法嗎?
Ans:鑑定
Culture:BA (α溶血)
Gram stain(GPC)→Catalase(-)→Drug
Drug: Oxacilin (S)需>20mm 才可發penicillin類 (R)
此法正確 為NCCL推薦使用的方法之一
另外的方法是MIC
20.試述知道細菌的運動性的方法(10) 機器血液培養的原理(10)
敘述細菌室現在有做PCR的檢驗為何(10)
Ans:種sim media 濃度range為0.5-1%
21.說明目前腸內菌鑑定方法趨勢為何?(請以分生方法為基礎)(30%)
22.Please describe the molecular methods used for rapid
diagnosis of Samonella typhimurium
分生的方法就如第7題所述~
23.How to detect the presence of bacteria in blood of a patient
with fever?
抽取病人的血，打入血液培養瓶，其內涵化學物質
若是有長菌會代謝產生大量的CO2，此時化學物質會產生螢光
可由機器偵測螢光
24.Please describe the processes for isolation and identification
of anaerobic bacteria in clinical laboratory
先將檢體種在GAM plate並於無氧箱培養，第2天及第9天各觀察一次，看是否長菌
若長菌了，先挑單一菌落做aero-tolerance test
看是否為strict anaerobe
若是strict anaerobe，先做gram stain及kanamycin colistin vancomycin做初步鑑定
接著作藥敏測試，輔以菌落型態及UV下的螢光作檢驗
最後上VITEK做自動化檢驗，比對與手工檢驗的結果
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