ligation

請問一下～～～

   我有一個ligation要作～～但是呢！我的insert很小大蓋只有40bp
    而我的vector是M13所以有7.2kb
    所以想請問一下~~有沒有人有做過這一種很小的insert要接到大vector上的呀!
    想請問的是要注意那一些特別的事項呢??



     因為我接了粉久粉久都接不上所以想問一下到底是有那一些事情是我沒有注意
     到的嗎???



    謝謝大家~~~~~~~~
--
☆ [Origin:椰林風情] [From: m5-109.ym.edu.tw] [Login: **] [Post: **]

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (Brahms), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 台大計中椰林風情站 (Sun Oct 22 08:41:01 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!bbs.ee.ntu!Palmarama

==> hybridoma ( 紫) 提到:
> 請問一下～～～
>    我有一個ligation要作～～但是呢！我的insert很小大蓋只有40bp
>     而我的vector是M13所以有7.2kb
>     所以想請問一下~~有沒有人有做過這一種很小的insert要接到大vector上的呀!
>     想請問的是要注意那一些特別的事項呢??
>      因為我接了粉久粉久都接不上所以想問一下到底是有那一些事情是我沒有注意
>      到的嗎???
>     謝謝大家~~~~~~~~

how do u check your transformants?
--
☆ [Origin:椰林風情] [From: h39.s150.ts31.hinet.net] [Login: **] [Post: **]

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] ( 紫), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 台大計中椰林風情站 (Sun Oct 22 12:09:24 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!bbs.ee.ntu!Palmarama

==> shrimp (Brahms) 提到:
> ==> hybridoma ( 紫) 提到:
> > 請問一下～～～
> >    我有一個ligation要作～～但是呢！我的insert很小大蓋只有40bp
> >     而我的vector是M13所以有7.2kb
> >     所以想請問一下~~有沒有人有做過這一種很小的insert要接到大vector上的呀!
> >     想請問的是要注意那一些特別的事項呢??
> >      因為我接了粉久粉久都接不上所以想問一下到底是有那一些事情是我沒有注意
> >      到的嗎???
> >     謝謝大家~~~~~~~~
> how do u check your transformants?
                      ??????????????

transformation ????
Do you say it ?

I checked the transformation efficiency by using wild type M13 and found that
there were no problem in competent cell preparation.
--
☆ [Origin:椰林風情] [From: m5-109.ym.edu.tw] [Login: **] [Post: **]

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (怎麼會有這種事!!!), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 元智大學風之塔 (Sun Oct 22 15:33:38 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!ctu-gate!news.nctu!news.ncu!news.yzu!bbs.yzu

※ 引述《[e-mail] ( 紫)》之銘言：
> 請問一下～～～
>    我有一個ligation要作～～但是呢！我的insert很小大蓋只有40bp
>     而我的vector是M13所以有7.2kb
>     所以想請問一下~~有沒有人有做過這一種很小的insert要接到大vector上的呀!
>     想請問的是要注意那一些特別的事項呢??
>      因為我接了粉久粉久都接不上所以想問一下到底是有那一些事情是我沒有注意
>      到的嗎???
>     謝謝大家~~~~~~~~

      你的insert fragment 是blunt end or stick end?blunt end ligation
      efficiency 會比較差.  還有ligation的condition如何?
      vector and insert conc. ratio? reaction temperature?
      說清楚一點大家比較好幫你
--
將你我
裝訂成書裡  不相鄰的兩頁
在層層阻隔中  能要時時感知
彼此的壓力

--
※ Origin: 元智大學 風之塔 <bbs.yzu.edu.tw> 
※ From  : h153.s44.ts30.HINET.NET

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (Brahms), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 台大計中椰林風情站 (Sun Oct 22 16:08:56 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!bbs.ee.ntu!Palmarama

==> hybridoma ( 紫) 提到:
> ==> shrimp (Brahms) 提到:
> > how do u check your transformants?
>                       ??????????????
> transformation ????
> Do you say it ?
> I checked the transformation efficiency by using wild type M13 and found that
> there were no problem in competent cell preparation.

我是指你是如何確定你的insert沒有接進去
--
☆ [Origin:椰林風情] [From: 140.109.48.185] [Login: **] [Post: **]

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (AlfaFan), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 中山醫學院BBS站 (Sun Oct 22 20:01:00 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!freebsd.ntu!news.cs.nthu!news.cis.nctu!csmcbbs

【 在 [e-mail] ( 紫) 的大作中提到: 】
: 請問一下～～～
:    我有一個ligation要作～～但是呢！我的insert很小大蓋只有40bp
:     而我的vector是M13所以有7.2kb
:     所以想請問一下~~有沒有人有做過這一種很小的insert要接到大vector上的呀!
:     想請問的是要注意那一些特別的事項呢??
:      因為我接了粉久粉久都接不上所以想問一下到底是有那一些事情是我沒有注意
:      到的嗎???
:     謝謝大家~~~~~~~~
  我之前做過一個ligation, vector有11.5kb, insert有80bp, 且是blunt end
  ligation, 狀況與你類似. 我的策略是提高insert濃度, mole數比約500:1.
  我是以restriction來判斷有無insert, 再以sequencing看insert的orientation,
  同時也可知道cloning過程有無導致sequence的錯誤.
  接不上的原因很多, 包括vector與insert的concentration, molar ratio, purity,
  etc. 如果你同時做個positive與negative control, 對你找出問題所在有很大幫助.
  謹提供參考參考!
--
  Sooner or Later, I WILL BE BACK.
  Maveric

※ 來源:‧中山醫學院BBS -- 絮情小站 bbs.csmc.edu.tw‧[FROM: 210.242.206.250]

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (會思考的魚), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 清華生命科學 BBS (Sun Oct 22 20:23:53 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!freebsd.ntu!news.cs.nthu!news.nthu!nthuls

※ 引述《[e-mail] ( 紫)》之銘言：
> 請問一下～～～
>    我有一個ligation要作～～但是呢！我的insert很小大蓋只有40bp
>     而我的vector是M13所以有7.2kb
>     所以想請問一下~~有沒有人有做過這一種很小的insert要接到大vector上的呀!
>     想請問的是要注意那一些特別的事項呢??
>      因為我接了粉久粉久都接不上所以想問一下到底是有那一些事情是我沒有注意
>      到的嗎???
>     謝謝大家~~~~~~~~
   嗯你的enzyme buffer 所含的ATP 不知有沒有不見
    加一點做TEST 看看
--
※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw> 
◆ From: 140.109.40.90

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (會思考的魚), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 台大醫學院◎楓城杏話◎ (Sun Oct 22 20:29:16 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!news.mc.ntu!Maple

※ 引述《[e-mail] (怎麼會有這種事!!!)》之銘言：
: ※ 引述《[e-mail] ( 紫)》之銘言：
: > 請問一下～～～
: >    我有一個ligation要作～～但是呢！我的insert很小大蓋只有40bp
: >     而我的vector是M13所以有a~~~~~~~~
:       你的insert fragment 是blunt end or stick end?blunt end ligation
:       efficiency 會比較差.  還有ligation的condition如何?
:       vector and insert conc. ratio? reaction temperature?
:       說清楚一點大家比較好幫你
          M13不是 單股的嗎應該沒有blunt and stick end 的問題吧
--
※ Origin: 楓城杏話 <bbs.mc.ntu.edu.tw> 
◆ From: 140.109.40.90

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (怎麼會有這種事!!!), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 元智大學風之塔 (Sun Oct 22 21:02:37 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!spring!news!news.ncu!news.yzu!bbs.yzu

※ 引述《[e-mail] (會思考的魚)》之銘言：
> ※ 引述《[e-mail] (怎麼會有這種事!!!)》之銘言：
> :       你的insert fragment 是blunt end or stick end?blunt end ligation
> :       efficiency 會比較差.  還有ligation的condition如何?
> :       vector and insert conc. ratio? reaction temperature?
> :       說清楚一點大家比較好幫你
>           M13不是 單股的嗎應該沒有blunt and stick end 的問題吧
          單股的plasmid?...可以解釋一下嘛...

--
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※ Origin: 元智大學 風之塔 <bbs.yzu.edu.tw> 
※ From  : h91.s44.ts30.HINET.NET

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (蛋白質男孩), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 台大計中椰林風情站 (Mon Oct 23 02:26:00 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!bbs.ee.ntu!Palmarama

==> [e-mail] (AlfaFan) 提到:
> 【 在 [e-mail] ( 紫) 的大作中提到: 】
>   我之前做過一個ligation, vector有11.5kb, insert有80bp, 且是blunt end
>   ligation, 狀況與你類似. 我的策略是提高insert濃度, mole數比約500:1.
>   我是以restriction來判斷有無insert, 再以sequencing看insert的orientation,
插個話..
用兩種restriction Ez 不就可以指定insert 的方向了嗎?

--
☆ [Origin:椰林風情] [From: 140.116.25.166] [Login: 14] [Post:  0]

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (AlfaFan), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 中山醫學院BBS站 (Fri Oct 27 01:09:29 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!freebsd.ntu!netnews.csie.nctu!ctu-peer!news.nctu!news.iim

【 在 [e-mail] (蛋白質男孩) 的大作中提到: 】
: 標  題: Re: ligation
: 發信站: 台大計中椰林風情站 (Mon Oct 23 02:26:00 2000)
: 轉信站: csmcbbs!news.cis.nctu!news.cs.nthu!freebsd.ntu!bbs.ee.ntu!Palmarama
: 
: ==> [e-mail] (AlfaFan) 提到:
: > 【 在 [e-mail] ( 紫) 的大作中提到: 】
: >   我之前做過一個ligation, vector有11.5kb, insert有80bp, 且是blunt end
: >   ligation, 狀況與你類似. 我的策略是提高insert濃度, mole數比約500:1.
: >   我是以restriction來判斷有無insert, 再以sequencing看insert的orientation,
: 插個話..
: 用兩種restriction Ez 不就可以指定insert 的方向了嗎
  問得好! 因為我的vector原本的cloning site只有兩個: BamHI與SmaI, 且此兩個sites
  重疊. 我自行加入一段unique restriction sites. 由於此vector有11.5K, 所以
  幾乎沒有好的restriction site可用(第一刀切unique site, 可是第二刀就不好選了!)
  所以才採定序決定方向, 同時也可知道我的insert的序列有無問題. 可算是
  摸蛤仔兼洗褲!  :)
--
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  Maveric

※ 來源:‧中山醫學院BBS -- 絮情小站 bbs.csmc.edu.tw‧[FROM: 210.242.206.250]

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (AlfaFan), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 中山醫學院BBS站 (Fri Oct 27 01:17:02 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!freebsd.ntu!netnews.csie.nctu!ctu-peer!ctu-gate!news.nctu

【 在 [e-mail] (怎麼會有這種事!!!) 的大作中提到: 】
: 標  題: Re: ligation
: 發信站: 元智大學風之塔 (Sun Oct 22 21:02:37 2000)
: 轉信站: csmcbbs!news.cis.nctu!freebsd.ntu!news.ntu!spring!news!news.ncu!news.yz
: Origin: bbs.yzu.edu.tw
: 
: ※ 引述《[e-mail] (會思考的魚)》之銘言：
: > ※ 引述《[e-mail] (怎麼會有這種事!!!)》之銘言：
: > :       你的insert fragment 是blunt end or stick end?blunt end ligation
: > :       efficiency 會比較差.  還有ligation的condition如何?
: > :       vector and insert conc. ratio? reaction temperature?
: > :       說清楚一點大家比較好幫你
: >           M13不是 單股的嗎應該沒有blunt and stick end 的問題吧
:           單股的plasmid?
  M13的DNA是single strand沒錯, 但這限定於包在phage中的genome才是.
  而其replication form的DNA則是double strand, 就像是plasmid般存在於
  菌的細胞中. 故cloning時是純化此RF DNA來做的, 所以當然有blunt與sticky end
  的考量.
  ps. 如果你拿single strand M13 DNA, 你怎麼切它? 又你的insert (double strand
      DNA)又如何接?
--
  Sooner or Later, I WILL BE BACK.
  Maveric

※ 來源:‧中山醫學院BBS -- 絮情小站 bbs.csmc.edu.tw‧[FROM: 210.242.206.250]

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (怎麼會有這種事!!!), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 元智大學風之塔 (Fri Oct 27 17:17:58 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!feeder.seed.net.tw!ctu-gate!news.nctu!news.ncu!news.yzu!b

※ 引述《[e-mail] (AlfaFan)》之銘言：
> 【 在 [e-mail] (怎麼會有這種事!!!) 的大作中提到: 】
> : 標  題: Re: ligation
> : 發信站: 元智大學風之塔 (Sun Oct 22 21:02:37 2000)
> : 轉信站: csmcbbs!news.cis.nctu!freebsd.ntu!news.ntu!spring!news!news.ncu!news.yz
> : Origin: bbs.yzu.edu.tw
> :           單股的plasmid?
>   M13的DNA是single strand沒錯, 但這限定於包在phage中的genome才是.
>   而其replication form的DNA則是double strand, 就像是plasmid般存在於
>   菌的細胞中. 故cloning時是純化此RF DNA來做的, 所以當然有blunt與sticky end
>   的考量.
>   ps. 如果你拿single strand M13 DNA, 你怎麼切它? 又你的insert (double strand
>       DNA)又如何接?
  Thanks...so M13 is the single strain DNA genome of one phage species..right?
  But manipulate the double strain replication form while digestion or
  ligation.
--
將你我
裝訂成書裡  不相鄰的兩頁
在層層阻隔中  能要時時感知
彼此的壓力

--
※ Origin: 元智大學 風之塔 <bbs.yzu.edu.tw> 
※ From  : ym64080.ym.edu.tw

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] ( 紫), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 台大計中椰林風情站 (Sat Oct 28 12:50:39 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!bbs.ee.ntu!Palmarama

==> [e-mail] (AlfaFan) 提到:
> 【 在 [e-mail] ( 紫) 的大作中提到: 】
> : 請問一下～～～
> :    我有一個ligation要作～～但是呢！我的insert很小大蓋只有40bp
> :     而我的vector是M13所以有7.2kb
> :     所以想請問一下~~有沒有人有做過這一種很小的insert要接到大vector上的呀!
> :     想請問的是要注意那一些特別的事項呢??
> :      因為我接了粉久粉久都接不上所以想問一下到底是有那一些事情是我沒有注意
> :      到的嗎???
> :     謝謝大家~~~~~~~~
>   我之前做過一個ligation, vector有11.5kb, insert有80bp, 且是blunt end
>   ligation, 狀況與你類似. 我的策略是提高insert濃度, mole數比約500:1.

   那我想問一下‵你的mole ratio is 500:1

   那你的vector放多少?在多少的體積呢?

--
☆ [Origin:椰林風情] [From: ym74022.ym.edu.tw] [Login: **] [Post: **]

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (AlfaFan), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 中山醫學院BBS站 (Sat Oct 28 21:47:00 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!freebsd.ntu!news.cs.nthu!news.cis.nctu!csmcbbs

【 在 [e-mail] (怎麼會有這種事!!!) 的大作中提到: 】
: ※ 引述《[e-mail] (AlfaFan)》之銘言：
:   Thanks...so M13 is the single strain DNA genome of one phage species..right?
:   But manipulate the double strain replication form while digestion or
:   ligation.
  That's right! :)
--
  Sooner or Later, I WILL BE BACK.
  Maveric

※ 來源:‧中山醫學院BBS -- 絮情小站 bbs.csmc.edu.tw‧[FROM: isdn-c139.csmc.]

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (AlfaFan), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 中山醫學院BBS站 (Sat Oct 28 22:12:31 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!freebsd.ntu!news.cs.nthu!news.cis.nctu!csmcbbs

【 在 [e-mail] ( 紫) 的大作中提到: 】
:    那我想問一下‵你的mole ratio is 500:1
:    那你的vector放多少?在多少的體積呢?
  vector: 100 ng; insert: 34 ng
  reaction vol.: 50 ul
--
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  Maveric

※ 來源:‧中山醫學院BBS -- 絮情小站 bbs.csmc.edu.tw‧[FROM: isdn-c139.csmc.]

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (會思考的魚), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 清華生命科學 BBS (Sun Oct 29 00:55:08 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!ctu-gate!news.nctu!newsfeed.nthu!news.nthu!nthuls

※ 引述《[e-mail] (AlfaFan)》之銘言：
> 【 在 [e-mail] ( 紫) 的大作中提到: 】
> :    那我想問一下‵你的mole ratio is 500:1
> :    那你的vector放多少?在多少的體積呢?
>   vector: 100 ng; insert: 34 ng
>   reaction vol.: 50 ul
   這vector也太多吧應該insert比vector多會比較好吧
   用10ng的vector就夠吧
--
※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw> 
◆ From: 140.109.40.90

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (AlfaFan), 看板: Biology
標  題: Re: ligation
發信站: 中山醫學院BBS站 (Sun Oct 29 23:30:29 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!freebsd.ntu!news.cs.nthu!news.cis.nctu!csmcbbs

【 在 [e-mail] (會思考的魚) 的大作中提到: 】
: 標  題: Re: ligation
: 發信站: 清華生命科學 BBS (Sun Oct 29 00:55:08 2000)
: 轉信站: csmcbbs!news.cis.nctu!news.cs.nthu!news.nthu!nthuls
: Origin: dot-net.life.nthu.edu.tw
: 
: ※ 引述《[e-mail] (AlfaFan)》之銘言：
: > 【 在 [e-mail] ( 紫) 的大作中提到: 】
: > :    那我想問一下‵你的mole ratio is 500:1
: > :    那你的vector放多少?在多少的體積呢?
: >   vector: 100 ng; insert: 34 ng
: >   reaction vol.: 50 ul
:    這vector也太多吧應該insert比vector多會比較好吧
:    用10ng的vector就夠吧
  這位大哥, 麻煩你算一下 molar ratio! OK?
  hybridoma兄問我放多少vector, 我以"重量"回答.
  先前我已提過, vector是11.5K, insert是80bp. 請以平均分子量660計算,
  看看molar ratio是不是500:1? 如果你斷章取義我也沒辦法.
--
  Sooner or Later, I WILL BE BACK.
  Maveric

※ 來源:‧中山醫學院BBS -- 絮情小站 bbs.csmc.edu.tw‧[FROM: 210.242.206.250]

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (...), 看板: Biology
標  題: Ligation的時間...
發信站: 輔仁大學美少女夢工場 BBS 站 (Fri Nov 24 20:09:30 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!spring!news.svdcc.fju!Princess



    ligation的時間通常都是overnight
    請問一下若是超過一天會不會影響ligation的效果?

--
※ 來源:‧美少女夢工場 bbs.svdcc.fju.edu.tw‧[FROM: bi211.bio.fju.edu.tw]