想請教一下 個人在做質體純化時 質體濃度及純度常常不盡理想
另外 在做限制脢反應時 出現的結果也粉奇怪
該切的不切 （沒出現 DNA BAND，應該會有2個BAND出現才對）
不該切的 （單切點，卻出現3條BAND）卻亂切
已經試過好多次 都一樣
這摸簡單的實驗都能做成這樣 我是不是該考慮轉行了呀...>_<...
--
☆ [Origin:椰林風情] [From: wii614-2.ch.ntust.edu.tw] [Login: **] [Post: **]
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: jamboree.bbs@bbs.ntu.edu.tw (微笑看世界), 看板: Biology
標 題: Re: 質體純化 與 限制脢反應...急!!! 求救...
發信站: 台大計中椰林風情站 (Sat Jul 1 03:57:52 2000)
轉信站: Ptt!bbs.ee.ntu!Palmarama
不曉得你在純化時是用kit還是用傳統方式
具我的經驗雖然土法煉鋼較耗時 但quality和quantity都會好很多
restriction enzyme切的好不好跟plasmed purity很有關係
亂切的情形 可能要check一下有沒有comtaminant的情形
(both雜菌and plasmid)
如果我是你我會把competent cell, medium 跟 plate全部換過
實驗作多了慢慢就有經驗了 不要氣餒
Good luck
==> Iceface (冷面冰顏) 提到:
> 想請教一下 個人在做質體純化時 質體濃度及純度常常不盡理想
> 另外 在做限制脢反應時 出現的結果也粉奇怪
> 該切的不切 （沒出現 DNA BAND，應該會有2個BAND出現才對）
> 不該切的 （單切點，卻出現3條BAND）卻亂切
> 已經試過好多次 都一樣
> 這摸簡單的實驗都能做成這樣 我是不是該考慮轉行了呀...>_<...
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: tip.bbs@will.m1.ntu.tw (維生方糖), 看板: Biology
標 題: Re: 質體純化 與 限制脢反應...急!!! 求救...
發信站: willbbs (Sat Jul 1 23:02:44 2000)
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※ 引述《Iceface.bbs@bbs.ntu.edu.tw (冷面冰顏)》之銘言：
: 想請教一下 個人在做質體純化時 質體濃度及純度常常不盡理想
: 另外 在做限制脢反應時 出現的結果也粉奇怪
: 該切的不切 （沒出現 DNA BAND，應該會有2個BAND出現才對）
: 不該切的 （單切點，卻出現3條BAND）卻亂切
: 已經試過好多次 都一樣
: 這摸簡單的實驗都能做成這樣 我是不是該考慮轉行了呀...>_<...
仔細想想有哪些過程有問題～
或是把實驗從頭到尾一五一十地說清楚，大家才好幫你呀....
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: yd008.bbs@bbs.nchu.edu.tw (黃狗), 看板: Biology
標 題: Re: 質體純化 與 限制脢反應...急!!! 求救..
發信站: 興大天樞資訊網 (Sun Jul 2 21:35:33 2000)
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==> 在 [Iceface.bbs@bbs.ntu.edu.tw] 文中提到:
: bs
: 想請教一下 個人在做質體純化時 質體濃度及純度常常不盡理想
: 另外 在做限制脢反應時 出現的結果也粉奇怪
: 該切的不切 （沒出現 DNA BAND，應該會有2個BAND出現才對）
: 不該切的 （單切點，卻出現3條BAND）卻亂切
: 已經試過好多次 都一樣
: 這摸簡單的實驗都能做成這樣 我是不是該考慮轉行了呀...>_<...
當初是挑單一菌株嗎??
請問這是甚麼質體(我是指ori 跟size 也就是考慮 copy No.)
切了以後 3 條DNA 大小的濃度關係(大小都不對嗎??最大的是不是跟質體一樣大)
確定單一切點嗎??
DNA 切好要做 ligation 嗎??
有用這兩種梅切過其他質體嗎??
是甚麼梅??
..................................
問題很多
今天
問到這裡
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: Iceface.bbs@bbs.ntu.edu.tw (冷面冰顏), 看板: Biology
標 題: Re: 質體純化 與 限制脢反應...急!!! 求救..
發信站: 台大計中椰林風情站 (Mon Jul 3 10:59:49 2000)
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==> yd008.bbs@bbs.nchu.edu.tw (黃狗) 提到:
> ==> 在 [Iceface.bbs@bbs.ntu.edu.tw] 文中提到:
> : bs
> : 想請教一下 個人在做質體純化時 質體濃度及純度常常不盡理想
> : 另外 在做限制脢反應時 出現的結果也粉奇怪
> : 該切的不切 （沒出現 DNA BAND，應該會有2個BAND出現才對）
> : 不該切的 （單切點，卻出現3條BAND）卻亂切
> : 已經試過好多次 都一樣
> : 這摸簡單的實驗都能做成這樣 我是不是該考慮轉行了呀...>_<...
> 當初是挑單一菌株嗎??
yes
> 請問這是甚麼質體(我是指ori 跟size 也就是考慮 copy No.)
pET-32b(+) 屬於 low copy no.
pET 30b 屬於 low copy no.
> 切了以後 3 條DNA 大小的濃度關係(大小都不對嗎??最大的是不是跟質體一樣大)
pET32b+(5900) Nde I x 2, Bpu1102 I x 1, EcoR I x 1
(346, 691) (80) (192)
pET30b / gene Nde I x 1, Bpu1102 I x 1, EcoR I x 1
6092/914 (1014) (80) (106)
marker 32b+B+N 32+N+E 30+B+N 30+E+N
-21227 - =
-5148 - - - =
-4973 -
-4268
-3530
-2027
-1904
-1584
-1375
-947 -
-831 =
-125
> 確定單一切點嗎??
> DNA 切好要做 ligation 嗎??
> 有用這兩種梅切過其他質體嗎??
> 是甚麼梅??
應該知道我所說的該切的不切 不該切的亂切了吧...:~~~
> ..................................
> 問題很多
> 今天
> 問到這裡
麻煩各位幫幫忙......
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: Iceface.bbs@bbs.ntu.edu.tw (冷面冰顏), 看板: Biology
標 題: Re: 質體純化 與 限制脢反應...急!!! 求救...
發信站: 台大計中椰林風情站 (Mon Jul 3 11:17:45 2000)
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==> blueberry.bbs@bbs.ee.nthu.edu.tw (茉 莉) 提到:
> ==> 在 jamboree.bbs@bbs.ntu.edu.tw (微笑看世界) 的文章中提到:
> > 不曉得你在純化時是用kit還是用傳統方式
> > 具我的經驗雖然土法煉鋼較耗時 但quality和quantity都會好很多
> > restriction enzyme切的好不好跟plasmed purity很有關係
> > 亂切的情形 可能要check一下有沒有comtaminant的情形
> > (both雜菌and plasmid)
為何會出現 comtaminant 的情形...?!?
如何改進...?!?
> > 如果我是你我會把competent cell, medium 跟 plate全部換過
> > 實驗作多了慢慢就有經驗了 不要氣餒
> > Good luck
已經試過了...純化和限制沒反應已經試了不下數次
medium, plate 都換過....
只差 沒有針對擬純化質體重新轉直了...:~~~
> 嗯..滿有道理的
> 不過..如果同時用兩個以上的enzyme切可能會有double digestion的問題
> 也就是說兩種enyzme互相干擾
> 通常出現這樣的情形..我建議你可以分開切
> 也就是說..先以一種enyzme切完(DNA最好多一點..enzyme也是)
> 再以酒精沉殿DNA...將enzyme去除..
> 最後加入dd水或TE buffer得到的DNA再以另一個enzyme切看看..
> 現在只想到這樣:)
> 祝好運:)
如果是這樣的話 揮不會增加污染了機會啊...?!?
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: tip.bbs@will.m1.ntu.tw (維生方糖), 看板: Biology
標 題: Re: 質體純化 與 限制脢反應...急!!! 求救..
發信站: willbbs (Mon Jul 3 12:42:45 2000)
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※ 引述《Iceface.bbs@bbs.ntu.edu.tw (冷面冰顏)》之銘言：
: ==> yd008.bbs@bbs.nchu.edu.tw (黃狗) 提到:
: > 當初是挑單一菌株嗎??
: yes
: > 請問這是甚麼質體(我是指ori 跟size 也就是考慮 copy No.)
: pET-32b(+) 屬於 low copy no.
: pET 30b 屬於 low copy no.
: > 切了以後 3 條DNA 大小的濃度關係(大小都不對嗎??最大的是不是跟質體一樣大)
: pET32b+(5900) Nde I x 2, Bpu1102 I x 1, EcoR I x 1
: (346, 691) (80) (192)
: pET30b / gene Nde I x 1, Bpu1102 I x 1, EcoR I x 1
: 6092/914 (1014) (80) (106)
: marker 32b+B+N 32+N+E 30+B+N 30+E+N
: -21227 - =
: -5148 - - - =
: -4973 -
: -4268
: -3530
: -2027
: -1904
: -1584
: -1375
: -947 -
: -831 =
: -125
: > 確定單一切點嗎??
: > DNA 切好要做 ligation 嗎??
: > 有用這兩種梅切過其他質體嗎??
: > 是甚麼梅??
: 應該知道我所說的該切的不切 不該切的亂切了吧...:~~~
請問你所有藥的用量是多少？
方便的話請你列出來.....好幫你找問題.....^^
: > ..................................
: > 問題很多
: > 今天
: > 問到這裡
: 麻煩各位幫幫忙......
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: Iceface.bbs@bbs.ntu.edu.tw (冷面冰顏), 看板: Biology
標 題: Re: 質體純化 與 限制脢反應...急!!! 求救..
發信站: 台大計中椰林風情站 (Mon Jul 3 15:03:11 2000)
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==> tip.bbs@will.m1.ntu.tw (維生方糖) 提到:
> ※ 引述《Iceface.bbs@bbs.ntu.edu.tw (冷面冰顏)》之銘言：
> : yes
> : pET-32b(+) 屬於 low copy no.
> : pET 30b 屬於 low copy no.
> : pET32b+(5900) Nde I x 2, Bpu1102 I x 1, EcoR I x 1
> : (346, 691) (80) (192)
> : pET30b / gene Nde I x 1, Bpu1102 I x 1, EcoR I x 1
> : 6092/914 (1014) (80) (106)
> : marker 32b+B+N 32+N+E 30+B+N 30+E+N
> : -21227 - =
> : -5148 - - - =
> : -4973 -
> : -4268
> : -3530
> : -2027
> : -1904
> : -1584
> : -1375
> : -947 -
> : -831 =
> : -125
> : 應該知道我所說的該切的不切 不該切的亂切了吧...:~~~
> 請問你所有藥的用量是多少？
> 方便的話請你列出來.....好幫你找問題.....^^
> : 麻煩各位幫幫忙......
配方
DNA 1 ul, concn= 1.1xx ug/ul
NEB #4 BUFFER 1 ul
1% BSA 1 ul
Enzyme 1 0.5 ul, 10U
Enzyme 2 0.5 ul, 10U
dd H2O 6 ul
再請各位指教....bow
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: tip.bbs@bbs.svdcc.fju.edu.tw (維生方糖), 看板: Biology
標 題: Re: 質體純化 與 限制脢反應...急!!! 求救..
發信站: 輔仁大學美少女夢工場 BBS 站 (Mon Jul 3 16:02:39 2000)
轉信站: Ptt!bbs.ee.ntu!news.ntu!spring!news.svdcc.fju!Princess
【 在 Iceface.bbs@bbs.ntu.edu.tw (冷面冰顏) 的大作中提到: 】
: ==> tip.bbs@will.m1.ntu.tw (維生方糖) 提到:
: > ※ 引述《Iceface.bbs@bbs.ntu.edu.tw (冷面冰顏)》之銘言：
: > 請問你所有藥的用量是多少？
: > 方便的話請你列出來.....好幫你找問題.....^^
: 配方
: DNA 1 ul, concn= 1.1xx ug/ul
: NEB #4 BUFFER 1 ul
: 1% BSA 1 ul
: Enzyme 1 0.5 ul, 10U
: Enzyme 2 0.5 ul, 10U
: dd H2O 6 ul
: 再請各位指教....bow
你用的Bpu1102I是哪家的啊？
如果是和NdeI同家，查查看做double digestion的表格，
用建議適用的buffer.....
如果不是，你可以算算兩家buffer的成份，找到適用的conc.
對了，enzyme可以減少至 0.3~0.4 ul.....
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: tip.bbs@bbs.svdcc.fju.edu.tw (維生方糖), 看板: Biology
標 題: Re: 質體純化 與 限制脢反應...急!!! 求救..
發信站: 輔仁大學美少女夢工場 BBS 站 (Mon Jul 3 16:11:50 2000)
轉信站: Ptt!bbs.ee.ntu!news.ntu!spring!news.svdcc.fju!Princess
【 在 Iceface.bbs@bbs.ntu.edu.tw (冷面冰顏) 的大作中提到: 】
: ==> tip.bbs@will.m1.ntu.tw (維生方糖) 提到:
: > ※ 引述《Iceface.bbs@bbs.ntu.edu.tw (冷面冰顏)》之銘言：
: > 請問你所有藥的用量是多少？
: > 方便的話請你列出來.....好幫你找問題.....^^
: 配方
: DNA 1 ul, concn= 1.1xx ug/ul
: NEB #4 BUFFER 1 ul
: 1% BSA 1 ul
: Enzyme 1 0.5 ul, 10U
: Enzyme 2 0.5 ul, 10U
: dd H2O 6 ul
: 再請各位指教....bow
忘了問，你知道insert flagment 的sequence嗎？
如果知道，做做分析，看看上面有沒有你用的enzyme recognition site...
如果沒有sequence, 換個enzyme試試.....或是做定序也是可以啦.....
不然就重做ligation......，省下找問題的時間....
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: Iceface.bbs@bbs.ntu.edu.tw (冷面冰顏), 看板: Biology
標 題: Re: 質體純化 與 限制脢反應...急!!! 求救..
發信站: 台大計中椰林風情站 (Mon Jul 3 16:52:17 2000)
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==> tip.bbs@bbs.svdcc.fju.edu.tw (維生方糖) 提到:
> 【 在 Iceface.bbs@bbs.ntu.edu.tw (冷面冰顏) 的大作中提到: 】
> : 配方
> : DNA 1 ul, concn= 1.1xx ug/ul
> : NEB #4 BUFFER 1 ul
> : 1% BSA 1 ul
> : Enzyme 1 0.5 ul, 10U
> : Enzyme 2 0.5 ul, 10U
> : dd H2O 6 ul
> : 再請各位指教....bow
> 你用的Bpu1102I是哪家的啊？
> 如果是和NdeI同家，查查看做double digestion的表格，
> 用建議適用的buffer.....
> 如果不是，你可以算算兩家buffer的成份，找到適用的conc.
> 對了，enzyme可以減少至 0.3~0.4 ul.....
不同家 A家是 B-enzyme, B家是 N-enzyme
但是 A家也有賣 N-enzyme, 只不過A家的 N-enzyme用完了
又沒現貨，所以......
但是 這會導致上述之差異嗎...?!?
這點我也有想到 而且 也做了測試 也就是:
分別以 A家 及 B家 所提供之 Buffer 來做
結果一樣........亂七八糟...:~~~
置於酵素量減少 mmm...為什麼勒...?!?...不懂耶...
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: Iceface.bbs@bbs.ntu.edu.tw (冷面冰顏), 看板: Biology
標 題: Re: 質體純化 與 限制脢反應...急!!! 求救..
發信站: 台大計中椰林風情站 (Mon Jul 3 17:05:26 2000)
轉信站: Ptt!bbs.ee.ntu!Palmarama
==> tip.bbs@bbs.svdcc.fju.edu.tw (維生方糖) 提到:
> 【 在 Iceface.bbs@bbs.ntu.edu.tw (冷面冰顏) 的大作中提到: 】
> : 配方
> : DNA 1 ul, concn= 1.1xx ug/ul
> : NEB #4 BUFFER 1 ul
> : 1% BSA 1 ul
> : Enzyme 1 0.5 ul, 10U
> : Enzyme 2 0.5 ul, 10U
> : dd H2O 6 ul
> : 再請各位指教....bow
> 忘了問，你知道insert flagment 的sequence嗎？
> 如果知道，做做分析，看看上面有沒有你用的enzyme recognition site...
> 如果沒有sequence, 換個enzyme試試.....或是做定序也是可以啦.....
> 不然就重做ligation......，省下找問題的時間....
都有CHECK過了 insert 上無切點
Sigh.......明明是粉簡單的實驗 為舌摸我會做成這樣
謝謝各位幫忙 再請各位繼續幫忙.....>_<....
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: "mike" <mlaimail@mars.seed.net.tw>, 看板: Biology
標 題: Re: 質體純化 與 限制脢反應...急!!! 求救...
發信站: Seeder_Net(阿波羅資訊網) (Wed Jul 5 17:28:33 2000)
轉信站: Ptt!bbs.ee.ntu!freebsd.ntu!netnews.csie.nctu!ctu-peer!ctu-gate!news.nc
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發信人: possu.bbs@bbs.ntu.edu.tw (天、地、生命), 看板: Biology
標 題: Re: 質體純化 與 限制脢反應...急!!! 求救..
發信站: 台大計中椰林風情站 (Thu Jul 6 09:04:34 2000)
轉信站: Ptt!bbs.ee.ntu!Palmarama
==> Iceface (冷面冰顏) 提到:
> pET32b+(5900) Nde I x 2, Bpu1102 I x 1, EcoR I x 1
> (346, 691) (80) (192)
> pET30b / gene Nde I x 1, Bpu1102 I x 1, EcoR I x 1
> 6092/914 (1014) (80) (106)
> marker 32b+B+N 32+N+E 30+B+N 30+E+N
> -21227 - =
> -5148 - - - =
> -4973 -
> -4268
> -3530
> -2027
> -1904
> -1584
> -1375
> -947 -
> -831 =
> -125
我能指出的第一個錯誤就是你用的enzyme concentration
EcoRI 有 Star activity
以你所列出的反應mixture concentration看來
你用0.5ul + 0.5ul enzyme in a total reaction volume of 10ul
這是剛好在star activity的boarder line....
建議你用0.5ul + 0.5ul enzyme in at least 20ul to 30ul
這可以解釋你30+E+N lane 的問題
我猜你所列出的Marker是以basepair 為單位
而你所列出的21227bp band 不可能是PET plasmid.
你的plasmid有可能是在5148bp附近的band.
如果以上說的是對的
你的前三個反應
有三種可能，你的plasmid prep有Genomic DNA containmination (lane 1,3)
而你所要的restrictional digest did not work.
第二種可能是你的plasmid 濃度不夠，所以你只能看到high molecular weight band
以你所列的gene (insertion) size= 914 這應該不是問題。
我不知道到底是怎麼一回事。
第三種可能，你在查看pET32b的反應，有些fragment實在太小，
以你所用的濃度根本就看不到。
etc. etc.. etc....
先試看看get rid of the star activity first...
remember to do a control experiment
good luck.
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: "Kanbo Lee" <u4304051@mail.scu.edu.tw>, 看板: Biology
標 題: Re: 質體純化 與 限制脢反應...急!!! 求救..
發信站: SooChow University 東吳大學 (Fri Jul 7 22:01:51 2000)
轉信站: Ptt!bbs.ee.ntu!news.ntu!spring!news!news.scu!not-for-mail
你跑電泳的agarose濃度是多少？？？
"天、地、生命" <possu.bbs@bbs.ntu.edu.tw> 撰寫於郵件
news:3bIDWY$He0@bbs.ntu.edu.tw...
> ==> Iceface (冷面冰顏) 提到:
> > pET32b+(5900) Nde I x 2, Bpu1102 I x 1, EcoR I x 1
> > (346, 691) (80) (192)
> > pET30b / gene Nde I x 1, Bpu1102 I x 1, EcoR I x 1
> > 6092/914 (1014) (80) (106)
> > marker 32b+B+N 32+N+E 30+B+N 30+E+N
> > -21227 - =
> > -5148 - - - =
> > -4973 -
> > -4268
> > -3530
> > -2027
> > -1904
> > -1584
> > -1375
> > -947 -
> > -831 =
> > -125
> 我能指出的第一個錯誤就是你用的enzyme concentration
> EcoRI 有 Star activity
> 以你所列出的反應mixture concentration看來
> 你用0.5ul + 0.5ul enzyme in a total reaction volume of 10ul
> 這是剛好在star activity的boarder line....
> 建議你用0.5ul + 0.5ul enzyme in at least 20ul to 30ul
> 這可以解釋你30+E+N lane 的問題
>
> 我猜你所列出的Marker是以basepair 為單位
> 而你所列出的21227bp band 不可能是PET plasmid.
> 你的plasmid有可能是在5148bp附近的band.
> 如果以上說的是對的
> 你的前三個反應
> 有三種可能，你的plasmid prep有Genomic DNA containmination (lane 1,3)
> 而你所要的restrictional digest did not work.
> 第二種可能是你的plasmid 濃度不夠，所以你只能看到high molecular weight band
> 以你所列的gene (insertion) size= 914 這應該不是問題。
> 我不知道到底是怎麼一回事。
> 第三種可能，你在查看pET32b的反應，有些fragment實在太小，
> 以你所用的濃度根本就看不到。
>
> etc. etc.. etc....
>
> 先試看看get rid of the star activity first...
>
> remember to do a control experiment
>
> good luck.
>
> --
> 誰能告訴我十年後的電腦會長得是什麼樣子？
> 希望不會長得像醜醜的PC....那會不會是漂漂的MAC呢？
> 很難說哩....會不會有一個新的怪胎叫...PAC....powered by Interola...
> 用的是Macindows OS....嗯，果然很難想像....
> -- 乖思@1996.CA.Anaheim.home
> --
> ☆ [Origin:椰林風情] [From: ms15.hinet.net] [Login: **] [Post: 76]