小弟最近利用PCR調出yeast中的某段基因
送到E. coli中
解果並不表達我要的蛋白質..why???
我是利用pET32/Xa的vector以及BL-21的competent cell
百思不解......望各位先進多多提點....thx
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* Origin: ★ 交通大學資訊科學系 BBS ★ <bbs.cis.nctu.edu.tw: 140.113.23.3>
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發信人: sharonstone.bbs@bbs.ntu.edu.tw (x的!機車掛掉了!), 看板: Biology
標 題: Re: 請問yeast的基因cloning到E. coli中不表達的原因?
發信站: 台大計中椰林風情站 (Wed Aug 16 21:09:59 2000)
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==> gst.bbs@cis.nctu.edu.tw (p ^_^ q.....加油) 提到:
> 小弟最近利用PCR調出yeast中的某段基因
> 送到E. coli中
> 解果並不表達我要的蛋白質..why???
> 我是利用pET32/Xa的vector以及BL-21的competent cell
> 百思不解......望各位先進多多提點....thx
1.modification?
2.被酵素吃吃吃...
3.codon usage?
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發信人: b4tt.bbs@bbs.ntu.edu.tw (水編織), 看板: Biology
標 題: Re: 請問yeast的基因cloning到E. coli中不表達的原因?
發信站: 台大計中椰林風情站 (Wed Aug 16 21:47:10 2000)
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> ==> gst.bbs@cis.nctu.edu.tw (p ^_^ q.....加油) 提到:
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> > 送到E. coli中
> > 解果並不表達我要的蛋白質..why???
> > 我是利用pET32/Xa的vector以及BL-21的competent cell
> > 百思不解......望各位先進多多提點....thx
> 1.modification?
> 2.被酵素吃吃吃...
> 3.codon usage?
我覺得最基本的問題有幾點要考慮：
1.是full length?因為你沒說是從哪個來源去釣PCR的。Library?
or genomic DNA?
2.接進vector的時候有檢查過有in frame嗎？
沒有的話當然做不出來！做出來的一定是你不想要的！
3.請問你蛋白質前面有tag嗎？如果有，多長？是什麼樣的tag?
那當初接進去的時候，target gene跟tag之間有多a.a.？？
目前只能有這樣的推想，我還需要查查pET32/Xa有什麼特性否？
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發信人: wto.bbs@bbs.life.nthu.edu.tw (邊緣), 看板: Biology
標 題: Re: 請問yeast的基因cloning到E. coli中不表達的原因?
發信站: 清華生命科學 BBS (Thu Aug 17 23:07:33 2000)
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※ 引述《gst.bbs@cis.nctu.edu.tw (p ^_^ q.....加油)》之銘言：
> 小弟最近利用PCR調出yeast中的某段基因
> 送到E. coli中
> 解果並不表達我要的蛋白質..why???
> 我是利用pET32/Xa的vector以及BL-21的competent cell
> 百思不解......望各位先進多多提點....thx
其實我現在也和你遭遇同樣的問題....
我是用vector:pGEX4T-1....competemt cell也是BL21
我是clone一段白血病基因..
要作成fusion protein
你的實驗過程有用到IPTG嗎??
會是induce的時間不夠嗎?
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發信人: ic.bbs@bbs.ntu.edu.tw (Ub), 看板: Biology
標 題: Re: 請問yeast的基因cloning到E. coli中不表達的原因?
發信站: 台大計中椰林風情站 (Fri Aug 18 04:11:11 2000)
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> > 小弟最近利用PCR調出yeast中的某段基因
> > 送到E. coli中
> > 解果並不表達我要的蛋白質..why???
> > 我是利用pET32/Xa的vector以及BL-21的competent cell
> > 百思不解......望各位先進多多提點....thx
> 其實我現在也和你遭遇同樣的問題....
> 我是用vector:pGEX4T-1....competemt cell也是BL21
> 我是clone一段白血病基因..
> 要作成fusion protein
> 你的實驗過程有用到IPTG嗎??
> 會是induce的時間不夠嗎?
check 一下insoluble fraction
有時真核生物的protein 在E.coli中因為種種因素
常常會aggregate而沉澱
你可以把whole cell + SDS sample buffer 煮上一陣子
看看你的蛋白質是沒有做還是沉澱掉了
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發信人: samurai.bbs@bbs.csie.nctu.edu.tw (教教我吧), 看板: Biology
標 題: Re: 請問yeast的基因cloning到E. coli中不表達的原因?
發信站: 交大資工鳳凰城資訊站 (Tue Aug 22 22:55:33 2000)
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※ 引述《gst.bbs@cis.nctu.edu.tw (p ^_^ q.....加油)》之銘言：
> 小弟最近利用PCR調出yeast中的某段基因
> 送到E. coli中
> 解果並不表達我要的蛋白質..why???
> 我是利用pET32/Xa的vector以及BL-21的competent cell
> 百思不解......望各位先進多多提點....thx
我認為您的問題不清楚耶！我想，如果您可以說的更清楚一點，也許板上的
先進們更容易幫上您的忙！
1.您如何知道plasmid已經送進去了？而且是你要的那個？
2.您如何知道你的construct會表現？有沒有作過sequencing確定inframe?
或是in-vitro translation證明可以做出protein？
3.您的所謂『不表達我要的蛋白質』是怎麼回事？
是偵測不到蛋白質本身？那麼偵測方法為何？
是偵測不到蛋白質的特殊活性？那麼活性偵測方法為何？
還是純化無法回收到該蛋白質？那麼純化的方法為何？
您有沒有檢驗一下RNA是否也是不表現？(northern blot or RT-PCR)？
4.您PCR吊出的是完整的含intron的gene還是只有cDNA，還是只有部分domain？
會不會有protein stability的問題？
5.您取了幾株clone？每個clone都這樣嗎？
6.您用怎樣的條件養菌來表現這個gene？
實驗可以在很多地方出問題，可是如果先進們無法follow您的實驗設計，
還是不能提供你什麼幫助啊！您說是不是？
附帶一提，這板上很多這種不清楚的問題，是否可以建議問問題的時候
應該多寫詳細一點？