實驗新手發問:
最近打PCR....
一般那種用兩個約20bp的primer夾起來的那種作的很順利.....
但遇到用約200bp的primer就一直打不好....
(我是要做一段有突變的DNA,先用兩個primer夾出一段,其中一個primer有突變...
這樣做出一段約200bp的megaprimer,再去打full-length的PCR)
通常是跑出來各種size都有....我所要的band不明顯....
在EtBr下就看到紅紅的一片....
這樣是megaprimer在annealing的時候專一性不夠的關係嗎?
200bp的primer要準確的粘在所要的位子上是不是很困難?那該如何解決?
還是有什麼可能因素?
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※ Origin: 臺大電機 Maxwell 站 ◆ From: 140.112.243.127
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發信人: tip.bbs@bbs.ntu.edu.tw (Tip), 看板: Biology
標 題: Re: PCR跑不好怎麼辦?
發信站: 台大計中椰林風情站 (Sat Aug 12 09:00:39 2000)
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==> flamma@bbs.ee.ntu.edu.tw (.........) 提到:
> 實驗新手發問:
> 最近打PCR....
> 一般那種用兩個約20bp的primer夾起來的那種作的很順利.....
> 但遇到用約200bp的primer就一直打不好....
> (我是要做一段有突變的DNA,先用兩個primer夾出一段,其中一個primer有突變...
> 這樣做出一段約200bp的megaprimer,再去打full-length的PCR)
> 通常是跑出來各種size都有....我所要的band不明顯....
> 在EtBr下就看到紅紅的一片....
> 這樣是megaprimer在annealing的時候專一性不夠的關係嗎?
> 200bp的primer要準確的粘在所要的位子上是不是很困難?那該如何解決?
> 還是有什麼可能因素?
primer好長喔～這樣真的可以做出來嗎？
沒有試過這麼長的primer說～
這樣的primer的Tm值要怎麼算呀？
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發信人: b4tt.bbs@bbs.ntu.edu.tw (水編織), 看板: Biology
標 題: Re: PCR跑不好怎麼辦?
發信站: 台大計中椰林風情站 (Wed Aug 16 22:16:26 2000)
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> > 最近打PCR....
> > 一般那種用兩個約20bp的primer夾起來的那種作的很順利.....
> > 但遇到用約200bp的primer就一直打不好....
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> > 這樣做出一段約200bp的megaprimer,再去打full-length的PCR)
> > 通常是跑出來各種size都有....我所要的band不明顯....
> > 在EtBr下就看到紅紅的一片....
> > 這樣是megaprimer在annealing的時候專一性不夠的關係嗎?
> > 200bp的primer要準確的粘在所要的位子上是不是很困難?那該如何解決?
> > 還是有什麼可能因素?
> primer好長喔～這樣真的可以做出來嗎？
> 沒有試過這麼長的primer說～
> 這樣的primer的Tm值要怎麼算呀？
這麼長的primer本來就不好P
不過你要確定你第一次的produt中沒有第一次PCR多餘的小primer
不然他們會亂P喔！所以最好做purify的工作！
如果是用gel elute的方式purify的話，請記得要過phenol/chloroform
去掉EtBr
當然PCR的condition要調阿！至少annealing的溫度要調高吧！
尤其你又是有做mutation的，慢慢調condition試試囉！