進行PCR時，產生Primer-Dimer的問題？

我在做PCR的時候，常常在小於100 bp的附近跑出很明顯的Band，想要的
product卻跑不出來。我覺得很可能是primer-dimer之類的產物，因為即使我
不放template下去，還是會有那些不是產物而bp數極小的Band。

我試了幾種溫度，可是結果還是不理想。我看兩組primer的3'端也沒有
互補的情形。這樣是不是要換一組primer來試試看呢？還是有什麼可以改善的方法？



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 * Origin: ★ 交通大學資訊科學系 BBS ★ <bbs.cis.nctu.edu.tw: 140.113.23.3>

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發信人: [e-mail] (呆子...), 看板: Biology
標  題: Re: 進行PCR時，產生Primer-Dimer的問題？
發信站: 奇摩大摩域 (Mon Jun 26 01:51:21 2000)
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※ 引述《[e-mail] (cell)》之銘言：
> 我在做PCR的時候，常常在小於100 bp的附近跑出很明顯的Band，想要的
> product卻跑不出來。我覺得很可能是primer-dimer之類的產物，因為即使我
> 不放template下去，還是會有那些不是產物而bp數極小的Band。
> 我試了幾種溫度，可是結果還是不理想。我看兩組primer的3'端也沒有
> 互補的情形。這樣是不是要換一組primer來試試看呢？還是有什麼可以改善的方法？

那些band會不會就是你放進去的primer啊?

你直接放primer下去跑電泳看看,
會不會再出現這樣的band?


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發信人: [e-mail] (逃), 看板: Biology
標  題: Re: 進行PCR時，產生Primer-Dimer的問題？
發信站: 中大資管龍貓資訊天地 (Mon Jun 26 04:11:34 2000)
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==> [e-mail] (cell) 提到:
: 我在做PCR的時候，常常在小於100 bp的附近跑出很明顯的Band，想要的
: product卻跑不出來。我覺得很可能是primer-dimer之類的產物，因為即使我
: 不放template下去，還是會有那些不是產物而bp數極小的Band。
: 我試了幾種溫度，可是結果還是不理想。我看兩組primer的3'端也沒有
: 互補的情形。這樣是不是要換一組primer來試試看呢？還是有什麼可以改善的方法？


  換個primer試試吧！！
  有時後primer不見的互補就可以做出你要的產物
  它有時後就是不爽黏上妳的template
  往template裡面或外面的序列重新設計primer再試試。
  祝妳好運呦！！實驗作不出來真得是粉無力耶！！！
  加油吧！！！


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發信人: [e-mail] (cell), 看板: Biology
標  題: Re: 進行PCR時，產生Primer-Dimer的問題？
發信站: 交大資科_BBS (Mon Jun 26 10:24:24 2000)
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==> 在 [e-mail] (呆子...) 的文章中提到:
> ※ 引述《[e-mail] (cell)》之銘言：
> > 我在做PCR的時候，常常在小於100 bp的附近跑出很明顯的Band，想要的
> > product卻跑不出來。我覺得很可能是primer-dimer之類的產物，因為即使我
> > 不放template下去，還是會有那些不是產物而bp數極小的Band。
> > 我試了幾種溫度，可是結果還是不理想。我看兩組primer的3'端也沒有
> > 互補的情形。這樣是不是要換一組primer來試試看呢？還是有什麼可以改善的方法？


> 那些band會不會就是你放進去的primer啊?
> 你直接放primer下去跑電泳看看,
> 會不會再出現這樣的band?

我只放primer不放template(sample)也是會跑出那些bp量很小的band，
所以我想是不是primer-dimers......:(


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發信人: [e-mail] (社長), 看板: Biology
標  題: Re: 進行PCR時，產生Primer-Dimer的問題？
發信站: 台大計中椰林風情站 (Mon Jun 26 11:29:59 2000)
轉信站: Ptt!bbs.ee.ntu!Palmarama

==> [e-mail] (逃) 提到:
> ==> [e-mail] (cell) 提到:
> : 我在做PCR的時候，常常在小於100 bp的附近跑出很明顯的Band，想要的
> : product卻跑不出來。我覺得很可能是primer-dimer之類的產物，因為即使我
> : 不放template下去，還是會有那些不是產物而bp數極小的Band。
> : 我試了幾種溫度，可是結果還是不理想。我看兩組primer的3'端也沒有
> : 互補的情形。這樣是不是要換一組primer來試試看呢？還是有什麼可以改善的方法？
>   換個primer試試吧！！
>   有時後primer不見的互補就可以做出你要的產物
>   它有時後就是不爽黏上妳的template

是啊！
Simply put, Some primers just do not work.

抄自紅皮書15.1.6

:)


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發信人: [e-mail] (等待...湯姆等待...), 看板: Biology
標  題: Re: 進行PCR時，產生Primer-Dimer的問題？
發信站: 台大計中椰林風情站 (Mon Jun 26 12:29:30 2000)
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==> [e-mail] (cell) 提到:
> 我在做PCR的時候，常常在小於100 bp的附近跑出很明顯的Band，想要的
> product卻跑不出來。我覺得很可能是primer-dimer之類的產物，因為即使我
> 不放template下去，還是會有那些不是產物而bp數極小的Band。
> 我試了幾種溫度，可是結果還是不理想。我看兩組primer的3'端也沒有
> 互補的情形。這樣是不是要換一組primer來試試看呢？還是有什麼可以改善的方法？


  這時候要看你的目的是什麼了喔
  如果你的product是要拿來作purify的話
  我會建議你換一組primer
  如果只是check的話
  你可以找看看在product的sequence中間是不是有RE site
  然後是primer沒有的
  用RE去切就知道了
  最後的方式是把band elute出來
  直接去做sequence就知道是什麼了
  因為我也遇過同樣的問題

                                 剛剛口試完的人..

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發信人: [e-mail] (維生方糖), 看板: Biology
標  題: Re: 進行PCR時，產生Primer-Dimer的問題？
發信站: willbbs (Fri Jun 30 12:57:28 2000)
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※ 引述《[e-mail] (cell)》之銘言：
: 我在做PCR的時候，常常在小於100 bp的附近跑出很明顯的Band，想要的
: product卻跑不出來。我覺得很可能是primer-dimer之類的產物，因為即使我
: 不放template下去，還是會有那些不是產物而bp數極小的Band。
: 我試了幾種溫度，可是結果還是不理想。我看兩組primer的3'端也沒有
: 互補的情形。這樣是不是要換一組primer來試試看呢？還是有什麼可以改善的方法？

先用軟体分析你的primer上有沒有dimer or hairpin的結構....
如果有，你可以試試加入Formamide（試試不同濃度），
或是primer加少些，template也加少些在做做看.....

ps:  你有沒有做annealing temperature 的測試呀？


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發信人: [e-mail] (維生方糖), 看板: Biology
標  題: Re: 進行PCR時，產生Primer-Dimer的問題？
發信站: willbbs (Fri Jun 30 13:01:22 2000)
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※ 引述《[e-mail] (逃)》之銘言：
: ==> [e-mail] (cell) 提到:
: : 我在做PCR的時候，常常在小於100 bp的附近跑出很明顯的Band，想要的
: : product卻跑不出來。我覺得很可能是primer-dimer之類的產物，因為即使我
: : 不放template下去，還是會有那些不是產物而bp數極小的Band。
: : 我試了幾種溫度，可是結果還是不理想。我看兩組primer的3'端也沒有
: : 互補的情形。這樣是不是要換一組primer來試試看呢？還是有什麼可以改善的方法？
:   換個primer試試吧！！
:   有時後primer不見的互補就可以做出你要的產物
:   它有時後就是不爽黏上妳的template
只要是設計良好的primer，在適當的annealing temperature下一定會與
template黏合，沒有爽不爽的說法.....
PCR做不出來的原因不少，不光是只有primer設計的問題......
:   往template裡面或外面的序列重新設計primer再試試。
:   祝妳好運呦！！實驗作不出來真得是粉無力耶！！！
:   加油吧！！！


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發信人: [e-mail] (維生方糖), 看板: Biology
標  題: Re: 進行PCR時，產生Primer-Dimer的問題？
發信站: willbbs (Fri Jun 30 13:03:03 2000)
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※ 引述《[e-mail] (cell)》之銘言：
: ==> 在 [e-mail] (呆子...) 的文章中提到:
: > 那些band會不會就是你放進去的primer啊?
: > 你直接放primer下去跑電泳看看,
: > 會不會再出現這樣的band?
: 我只放primer不放template(sample)也是會跑出那些bp量很小的band，
: 所以我想是不是primer-dimers......:(

從頭檢查吧～
primer design,PCR material, buffer, programs.........


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發信人: [e-mail] (維生方糖), 看板: Biology
標  題: Re: 進行PCR時，產生Primer-Dimer的問題？
發信站: willbbs (Fri Jun 30 13:04:11 2000)
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※ 引述《[e-mail] (社長)》之銘言：
: ==> [e-mail] (逃) 提到:
: >   換個primer試試吧！！
: >   有時後primer不見的互補就可以做出你要的產物
: >   它有時後就是不爽黏上妳的template
: 是啊！
: Simply put, Some primers just do not work.
: 抄自紅皮書15.1.6
  ^^^^^^^^^^
不好意思，請問〞紅皮書〞指的是哪一本呀？.....
: :)


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發信人: [e-mail] (維生方糖), 看板: Biology
標  題: Re: 進行PCR時，產生Primer-Dimer的問題？
發信站: willbbs (Fri Jun 30 13:13:58 2000)
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※ 引述《[e-mail] (等待...湯姆等待...)》之銘言：
: ==> [e-mail] (cell) 提到:
: > 我在做PCR的時候，常常在小於100 bp的附近跑出很明顯的Band，想要的
: > product卻跑不出來。我覺得很可能是primer-dimer之類的產物，因為即使我
: > 不放template下去，還是會有那些不是產物而bp數極小的Band。
: > 我試了幾種溫度，可是結果還是不理想。我看兩組primer的3'端也沒有
: > 互補的情形。這樣是不是要換一組primer來試試看呢？還是有什麼可以改善的方法？
:   這時候要看你的目的是什麼了喔
:   如果你的product是要拿來作purify的話
:   我會建議你換一組primer
:   如果只是check的話
:   你可以找看看在product的sequence中間是不是有RE site
:   然後是primer沒有的
:   用RE去切就知道了
:   最後的方式是把band elute出來
:   直接去做sequence就知道是什麼了
:   因為我也遇過同樣的問題
:                                  剛剛口試完的人..

這太麻煩了吧～
要找product的restriction map, 必須要有sequence才行，
如果是未知的product，得用T-vector接合後在host中大量表現後才能去定序，
當然直接定序也成，端看要用什麼方式...
有了sequence，先要去分析，然後要看看手邊有沒有適用的enzyme,
沒有還得想辦法（用借的or用買的）； 小於100bp還要用restriction enzyme去切，
切完還得跑電泳.......

很麻煩的........