因為一直P不出來，不知道有沒有高手可以解答呢？
謝謝
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承諾我一片藍色天空 無牽無掛自由如風
不為情所累 不為情所苦 讓我一輩子都被愛縱容
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※ Origin: 清華電機 ◆ From: Chiang2.ns.nthu.edu.tw
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: shrimp.bbs@bbs.ntu.edu.tw (Brahms), 看板: Biology
標 題: Re: 請問要PCR一段2k bp的DNA該如何做才好？
發信站: 台大計中椰林風情站 (Tue Aug 8 16:38:04 2000)
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==> whb.bbs@bbs.ee.nthu.edu.tw (清亮湛藍的晴空) 提到:
> 因為一直P不出來，不知道有沒有高手可以解答呢？
> 謝謝
請問你的PCR condition??
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: pill.bbs@bbs.cs.nthu.edu.tw (Save Our Soul), 看板: Biology
標 題: Re: 請問要PCR一段2k bp的DNA該如何做才好？
發信站: 清華資訊(楓橋驛站) (Tue Aug 8 23:23:23 2000)
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※ 引述《shrimp.bbs@bbs.ntu.edu.tw (Brahms)》之銘言：
> ==> whb.bbs@bbs.ee.nthu.edu.tw (清亮湛藍的晴空) 提到:
> > 因為一直P不出來，不知道有沒有高手可以解答呢？
> > 謝謝
> 請問你的PCR condition??
試試用ex Taq
或者換一家酵素try 看看
我覺得TaKaRa的不錯
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: wheels.bbs@bbs.ntu.edu.tw (做完實驗吃早餐), 看板: Biology
標 題: Re: 請問要PCR一段2k bp的DNA該如何做才好？
發信站: 台大計中椰林風情站 (Wed Aug 9 09:08:56 2000)
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==> pill.bbs@bbs.cs.nthu.edu.tw (Save Our Soul) 提到:
> ※ 引述《shrimp.bbs@bbs.ntu.edu.tw (Brahms)》之銘言：
> > 請問你的PCR condition??
> 試試用ex Taq
> 或者換一家酵素try 看看
> 我覺得TaKaRa的不錯
我覺得TaKaRa和pfu Turblo都不錯！
都很暴力，
我有用過pfu cloned PCR做出大約1.6kb的產物，
量還不少，很輕鬆的就做完cloning。
不過可能要考慮延長elongation time。
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: tip.bbs@bbs.ntu.edu.tw (Tip), 看板: Biology
標 題: Re: 請問要PCR一段2k bp的DNA該如何做才好？
發信站: 台大計中椰林風情站 (Wed Aug 9 09:37:20 2000)
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==> wheels (做完實驗吃早餐) 提到:
> ==> pill.bbs@bbs.cs.nthu.edu.tw (Save Our Soul) 提到:
> > 試試用ex Taq
> > 或者換一家酵素try 看看
> > 我覺得TaKaRa的不錯
> 我覺得TaKaRa和pfu Turblo都不錯！
> 都很暴力，
> 我有用過pfu cloned PCR做出大約1.6kb的產物，
> 量還不少，很輕鬆的就做完cloning。
> 不過可能要考慮延長elongation time。
不過做出來後最好做個定序，以確保序列的正確性。
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: whb.bbs@bbs.ee.nthu.edu.tw (清亮湛藍的晴空), 看板: Biology
標 題: Re: 請問要PCR一段2k bp的DNA該如何做才好？
發信站: ☆清華電機☆ (Wed Aug 9 10:01:00 2000)
轉信站: Ptt!bbs.ee.ntu!freebsd.ntu!netnews.csie.nctu!news.ee.nthu!star
==> 在 wheels.bbs@bbs.ntu.edu.tw (做完實驗吃早餐) 的文章中提到:
> ==> pill.bbs@bbs.cs.nthu.edu.tw (Save Our Soul) 提到:
> > 試試用ex Taq
> > 或者換一家酵素try 看看
> > 我覺得TaKaRa的不錯
> 我覺得TaKaRa和pfu Turblo都不錯！
> 都很暴力，
^^^^^這是什麼意思呀？
TakaRa & pfu Turblo是廠牌嗎？
要跟哪一家廠商定呀？
大概的價位是多少呢？
> 我有用過pfu cloned PCR做出大約1.6kb的產物，
> 量還不少，很輕鬆的就做完cloning。
> 不過可能要考慮延長elongation time。
延長是延到多長呢？
The PCR condition is in a 50 ml reaction mixture
with 250 mM of each dNTP, 100 nM of primers, 5 ml
of 10x buffer and 1 unit of Tag DNA polymerase
using 30 cycles (94oC, 1 min, 62oC, 1.5 min, and 72oC, 2.5 min).
這是我用的condition，但這樣還是P不出來，
那假如使用你們說的酵素
condition是如何呢？有哪些需要注意的地方呢？
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: whb.bbs@bbs.ee.nthu.edu.tw (清亮湛藍的晴空), 看板: Biology
標 題: Re: 請問要PCR一段2k bp的DNA該如何做才好？
發信站: ☆清華電機☆ (Wed Aug 9 16:49:09 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!freebsd.ntu!news.cs.nthu!newsfeed.nthu!news.ee.nthu!star
==> 在 u4304051@mail.scu.edu.tw (Kanbo Lee) 的文章中提到:
> 你的anealing temperature會不會太高了？ 62℃喔！
> 你的primer tm值是多少？
我的primer有33bp，所以算出來的Tm=67oC
之前也用過58oC，一樣P不出來
苦惱呀
難道要換一個primer?????
還在想辦法中
> > The PCR condition is in a 50 ml reaction mixture
> > with 250 mM of each dNTP, 100 nM of primers, 5 ml
> > of 10x buffer and 1 unit of Tag DNA polymerase
> > using 30 cycles (94oC, 1 min, 62oC, 1.5 min, and 72oC, 2.5 min).
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: benbell.bbs@bbs.yzu.edu.tw (珍貴的大憨蓮...), 看板: Biology
標 題: Re: 請問要PCR一段2k bp的DNA該如何做才好？
發信站: 元智大學風之塔 (Wed Aug 9 17:26:15 2000)
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※ 引述《whb.bbs@bbs.ee.nthu.edu.tw (清亮湛藍的晴空)》之銘言：
> ==> 在 u4304051@mail.scu.edu.tw (Kanbo Lee) 的文章中提到:
> > 你的anealing temperature會不會太高了？ 62℃喔！
> > 你的primer tm值是多少？
> 我的primer有33bp，所以算出來的Tm=67oC
> 之前也用過58oC，一樣P不出來
> 苦惱呀
> 難道要換一個primer?????
> 還在想辦法中
恩...提供一個方法讓你參考
若是2K的片段真的很難P出來的話
或許可以試試看設計多一點primer
將2K的長度分成3~5個部分來P
然後再將這些片段用ligase連接起來
但是前提是primer的設計很重要..要再尾端設計相連的restriction site
接起來還要保持序列的正確性
這個方法比較耗功夫...但是或許可以試試看
這種方法的好處是..由於每一個PCR反應長度比較短
序列產生變化的機率也比較少
2K是個不短的長度...要做的好又正確可能比較難..
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: Douglas.bbs@bbs.ntu.edu.tw (社長), 看板: Biology
標 題: Re: 請問要PCR一段2k bp的DNA該如何做才好？
發信站: 台大計中椰林風情站 (Wed Aug 9 17:19:47 2000)
轉信站: Ptt!bbs.ee.ntu!Palmarama
==> whb.bbs@bbs.ee.nthu.edu.tw (清亮湛藍的晴空) 提到:
> ==> 在 wheels.bbs@bbs.ntu.edu.tw (做完實驗吃早餐) 的文章中提到:
> 延長是延到多長呢？
> The PCR condition is in a 50 ml reaction mixture
> with 250 mM of each dNTP, 100 nM of primers, 5 ml
> of 10x buffer and 1 unit of Tag DNA polymerase
> using 30 cycles (94oC, 1 min, 62oC, 1.5 min, and 72oC, 2.5 min).
> 這是我用的condition，但這樣還是P不出來，
> 那假如使用你們說的酵素
> condition是如何呢？有哪些需要注意的地方呢？
你寫的mL 應該寫成microliter 吧！ （別嚇人了）
250mM dNTP 好像有點多，red book 建議最多 200 microMolar
或者調整buffer 裡MgCl2 的濃度。不過不是每家公司的enzyme 都能調，
像 KlenTaq 就不行，Expand hifidelity 就可以
若都不行，只好再請你把你的 primer sequence 貼上來大家討論了
有問題的話，歡迎到台大椰林風情BBS 生物技術交流版 主選單下按s 輸入 BCT 即可
:)
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: biotech (id想好久) 看板: Biology
標題: Re: 請問要PCR一段2k bp的DNA該如何做才好？
時間: Wed Aug 9 19:53:37 2000
※ 引述《Douglas.bbs@bbs.ntu.edu.tw (社長)》之銘言：
: ==> whb.bbs@bbs.ee.nthu.edu.tw (清亮湛藍的晴空) 提到:
: > 延長是延到多長呢？
: > The PCR condition is in a 50 ml reaction mixture
: > with 250 mM of each dNTP, 100 nM of primers, 5 ml
: > of 10x buffer and 1 unit of Tag DNA polymerase
: > using 30 cycles (94oC, 1 min, 62oC, 1.5 min, and 72oC, 2.5 min).
: > 這是我用的condition，但這樣還是P不出來，
: > 那假如使用你們說的酵素
: > condition是如何呢？有哪些需要注意的地方呢？
: 你寫的mL 應該寫成microliter 吧！ （別嚇人了）
: 250mM dNTP 好像有點多，red book 建議最多 200 microMolar
: 或者調整buffer 裡MgCl2 的濃度。不過不是每家公司的enzyme 都能調，
: 像 KlenTaq 就不行，Expand hifidelity 就可以
: 若都不行，只好再請你把你的 primer sequence 貼上來大家討論了
: 有問題的話，歡迎到台大椰林風情BBS 生物技術交流版 主選單下按s 輸入 BCT 即可
: :)
那還有沒有可能是一些其他問題
例如GC-rich等等 需要一些特殊的kit輔助
或者使用next-pcr(不知道是不是這樣說 就是pcr兩次)增強靈敏度
參考參考
> -------------------------------------------------------------------------- <
作者: Throbber (蘇云金芽胞桿菌Ｌ型) 看板: Biology
標題: Re: 請問要PCR一段2k bp的DNA該如何做才好？
時間: Wed Aug 9 20:50:29 2000
※ 引述《biotech (id想好久)》之銘言：
: ※ 引述《Douglas.bbs@bbs.ntu.edu.tw (社長)》之銘言：
: : 你寫的mL 應該寫成microliter 吧！ （別嚇人了）
: : 250mM dNTP 好像有點多，red book 建議最多 200 microMolar
: : 或者調整buffer 裡MgCl2 的濃度。不過不是每家公司的enzyme 都能調，
: : 像 KlenTaq 就不行，Expand hifidelity 就可以
: : 若都不行，只好再請你把你的 primer sequence 貼上來大家討論了
: : 有問題的話，歡迎到台大椰林風情BBS 生物技術交流版 主選單下按s 輸入 BCT 即可
: 那還有沒有可能是一些其他問題
: 例如GC-rich等等 需要一些特殊的kit輔助
: 或者使用next-pcr(不知道是不是這樣說 就是pcr兩次)增強靈敏度
: 參考參考
Nest-PCR，用兩對primer，
不過對於兩千這麼大的size，
Nest-PCR大概也無能為力。
建議把每個cycle的第三個時間（elongation）漸增，
一循環增加十秒鐘吧，而且用pfu真的比用Taq好，
不然妳的PCR product裡面都是錯誤。
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: tip.bbs@bbs.ntu.edu.tw (Tip), 看板: Biology
標 題: Re: 請問要PCR一段2k bp的DNA該如何做才好？
發信站: 台大計中椰林風情站 (Thu Aug 10 10:04:38 2000)
轉信站: Ptt!bbs.ee.ntu!Palmarama
==> whb.bbs@bbs.ee.nthu.edu.tw (清亮湛藍的晴空) 提到:
> ==> 在 u4304051@mail.scu.edu.tw (Kanbo Lee) 的文章中提到:
> > 你的anealing temperature會不會太高了？ 62℃喔！
> > 你的primer tm值是多少？
> 我的primer有33bp，所以算出來的Tm=67oC
> 之前也用過58oC，一樣P不出來
> 苦惱呀
> 難道要換一個primer?????
> 還在想辦法中
你可以試試加入foramide，可以減少primer secondary structure及降低annealing tm
至於濃度，你可以試試1~5% (final conc.)看看......
可以利用軟体（ eq. NT-Vector)來估計Tm值.....
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: tip.bbs@bbs.ntu.edu.tw (Tip), 看板: Biology
標 題: Re: 請問要PCR一段2k bp的DNA該如何做才好？
發信站: 台大計中椰林風情站 (Thu Aug 10 10:06:09 2000)
轉信站: Ptt!bbs.ee.ntu!Palmarama
==> Throbber.bbs@ptt.csie.ntu.edu.tw (蘇云金芽胞桿菌Ｌ型) 提到:
> ※ 引述《biotech (id想好久)》之銘言：
> : 那還有沒有可能是一些其他問題
> : 例如GC-rich等等 需要一些特殊的kit輔助
> : 或者使用next-pcr(不知道是不是這樣說 就是pcr兩次)增強靈敏度
> : 參考參考
> Nest-PCR，用兩對primer，
> 不過對於兩千這麼大的size，
> Nest-PCR大概也無能為力。
> 建議把每個cycle的第三個時間（elongation）漸增，
> 一循環增加十秒鐘吧，而且用pfu真的比用Taq好，
> 不然妳的PCR product裡面都是錯誤。
可以試試Overlapping extention......
不過我沒做過，僅看過paper而已......
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: possu.bbs@bbs.ntu.edu.tw (天、地、生命), 看板: Biology
標 題: Re: 請問要PCR一段2k bp的DNA該如何做才好？
發信站: 台大計中椰林風情站 (Sat Aug 12 19:48:23 2000)
轉信站: Ptt!bbs.ee.ntu!Palmarama
==> whb.bbs@bbs.ee.nthu.edu.tw (清亮湛藍的晴空) 提到:
> ==> 在 u4304051@mail.scu.edu.tw (Kanbo Lee) 的文章中提到:
> > 你的anealing temperature會不會太高了？ 62℃喔！
> > 你的primer tm值是多少？
> 我的primer有33bp，所以算出來的Tm=67oC
> 之前也用過58oC，一樣P不出來
> 苦惱呀
> 難道要換一個primer?????
> 還在想辦法中
Some suggestions:
1. Even 58 degree is still on the high end for most PCR.
What is the template? A vector? A library?
Even though your calculation gives 67 degree annealing,
you can actually do the experiment at around 50.
2. Taq is okay, but pfu (or other proofreading enzymes) are highly recommended.
3. Definately increase your extension time.
4. add an additional step (72 degrees for 10 min, for example) after
your 30 cycle program.