請問各位以pfu做PCR時如果一直做不出來有那些地方要注意的
total 25 ul
temp(cDNA) 5 ul 為1.8Kb的基因從yeast來的cDNA
10x buffer 2.5ul
dNTP(2.5mM) 4 ul
PRIMER(10pMOL)F 1 ul
R 1 ul
pfu (2.5U/ul) 0.5ul
+H2O至25ul
時間:
1 95 5min
2 95 1min
3 56 1min
4 72 2min (35 cycle)
5 72 12min
做了粉多的不同嘗試一直做不出來但用 Taq做的出來(到65度都可以)
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◆ From: 140.109.40.90
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標 題: Re: 用pfu做PCR的問題
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【 在 albertwang.bbs@bbs.life.nthu.edu.tw (會思考的魚) 的大作中提到: 】
: 請問各位以pfu做PCR時如果一直做不出來有那些地方要注意的
: total 25 ul
: temp(cDNA) 5 ul 為1.8Kb的基因從yeast來的cDNA
template為多少mole? 無法從你寫的體積中知道DNA濃度. 濃度偏高也不利
反應的進行!
: 10x buffer 2.5ul
: dNTP(2.5mM) 4 ul
dNTP一般是用250uM (final concentration), dNTP太多反而不利反應.
: PRIMER(10pMOL)F 1 ul
: R 1 ul
primer放到10 pmol太多了, 雖不會影響反應但嫌浪費.
: pfu (2.5U/ul) 0.5ul
: +H2O至25ul
: 時間:
: 1 95 5min
: 2 95 1min
: 3 56 1min
: 4 72 2min (35 cycle)
: 5 72 12min
: 做了粉多的不同嘗試一直做不出來但用 Taq做的出來(到65度都可以)
我想還有一可能是template不乾淨. 特別是從agarose gel回收的DNA.
如果你用的agarose不是頂級的(e.g., FMC GTG grade), 那gel所含的一些硫酸根
離子偏高, 而傳統回收法是去不掉這些離子的. 所以我建議你用一些kit (如
Qiagen的gel pudification kit)做回收再試試看.
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標 題: Re: 用pfu做PCR的問題
發信站: 台大計中椰林風情站 (Mon Sep 25 10:23:46 2000)
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如果你是要做cloning，
taq又可以用就用taq做就可以了，
其實挑到的clone有mutation的比率相當的低，
如果你還是擔心，可以用其他家的試試像takara.....
我以前聽到的與你相反，pfu可以，taq不可以。
還有，你的template太濃了。
我聽到隔壁實驗室拿我抽的cDNA做cloning，
勢將0.6ug/ul的DNA dilute 100取1 ul做，
就可以了。
==> albertwang.bbs@bbs.life.nthu.edu.tw (會思考的魚) 提到:
> 請問各位以pfu做PCR時如果一直做不出來有那些地方要注意的
> total 25 ul
> temp(cDNA) 5 ul 為1.8Kb的基因從yeast來的cDNA
> 10x buffer 2.5ul
> dNTP(2.5mM) 4 ul
> PRIMER(10pMOL)F 1 ul
> R 1 ul
> pfu (2.5U/ul) 0.5ul
> +H2O至25ul
> 時間:
> 1 95 5min
> 2 95 1min
> 3 56 1min
> 4 72 2min (35 cycle)
> 5 72 12min
> 做了粉多的不同嘗試一直做不出來但用 Taq做的出來(到65度都可以)
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發信人: albertwang.bbs@bbs.life.nthu.edu.tw (會思考的魚), 看板: Biology
標 題: Re: 用pfu做PCR的問題
發信站: 清華生命科學 BBS (Mon Sep 25 22:15:37 2000)
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> : temp(cDNA) 5 ul 為1.8Kb的基因從yeast來的cDNA
> template為多少mole? 無法從你寫的體積中知道DNA濃度. 濃度偏高也不利
> 反應的進行!
嗯我是沒測過
> : 10x buffer 2.5ul
> : dNTP(2.5mM) 4 ul
> dNTP一般是用250uM (final concentration), dNTP太多反而不利反應.
> : PRIMER(10pMOL)F 1 ul
> : R 1 ul
> primer放到10 pmol太多了, 雖不會影響反應但嫌浪費.
> : 真的啊這還太多啊那個場商的目錄寫的比這還要濃說
那我用少一點試試
pfu (2.5U/ul) 0.5ul
> : +H2O至25ul
> : 時間:
> : 做了粉多的不同嘗試一直做不出來但用 Taq做的出來(到65度都可以)
> 我想還有一可能是template不乾淨. 特別是從agarose gel回收的DNA.
> 如果你用的agarose不是頂級的(e.g., FMC GTG grade), 那gel所含的一些硫酸根
> 離子偏高, 而傳統回收法是去不掉這些離子的. 所以我建議你用一些kit (如
> Qiagen的gel pudification kit)做回收再試試看.
喔我的cDNA是從YEAST抽取來的mRNA直接做cDNA
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標 題: Re: 用pfu做PCR的問題
發信站: 台大計中椰林風情站 (Tue Sep 26 10:10:09 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!bbs.ee.ntu!Palmarama
不知道你的buffer裡有沒有Mg++
你可以試試看加多一點鎂離子(建議量的2-3倍)
我的pfu PCR 就是這樣做出來的
Good luck
==> albertwang.bbs@bbs.life.nthu.edu.tw (會思考的魚) 提到:
> 請問各位以pfu做PCR時如果一直做不出來有那些地方要注意的
> total 25 ul
> temp(cDNA) 5 ul 為1.8Kb的基因從yeast來的cDNA
> 10x buffer 2.5ul
> dNTP(2.5mM) 4 ul
> PRIMER(10pMOL)F 1 ul
> R 1 ul
> pfu (2.5U/ul) 0.5ul
> +H2O至25ul
> 時間:
> 1 95 5min
> 2 95 1min
> 3 56 1min
> 4 72 2min (35 cycle)
> 5 72 12min
> 做了粉多的不同嘗試一直做不出來但用 Taq做的出來(到65度都可以)
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發信人: Maveric.bbs@bbs.csmc.edu.tw (AlfaFan), 看板: Biology
標 題: Re: 用pfu做PCR的問題
發信站: 中山醫學院BBS站 (Tue Sep 26 16:10:21 2000)
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【 在 albertwang.bbs@bbs.life.nthu.edu.tw (會思考的魚) 的大作中提到: 】
: 嗯我是沒測過
: 那我用少一點試試
我的primer用量最多不超過5 pmol, 通常放3 pmol, 如果有32P標定則1.5 pmol就
很多了!
: pfu (2.5U/ul) 0.5ul
: 喔我的cDNA是從YEAST抽取來的mRNA直接做cDNA
OK, 看到這裡知道你的cDNA是從RT過來的. 所以首要工作是
驗證RT沒問題. -->用另一組已知的primer做RT及PCR當internal control.
同時, template取5 ul, 換句話說PCR的buffer已不是原始的1X buffer, 故有必要
算一下目前buffer中的pH值, 離子濃度等. 雖說DNA pol.的活性與Mg++有密切關係,
但Na+, K+也會影響 (主要是ionic strength, 影響protein conformation).
可以先取少一點RT產物試看看 (或經dilute). 如果還是不行, 只好再純化RT產物. 我
都是用Qiagen的nucleotide removing kit, 方便且回收率高.