sample萃取完tatal DNA之後的電泳很正常(亮度,位置皆正確)
可是跑PCR之後就是沒有產物
一開始懷疑是PCR的藥有問題,後來我拿之前做過的sample一起跑
結果顯示之前的sample一切正常,就是單單此次的samle失敗
為避免雜訊干擾,也已經試過好幾種不同的稀釋倍數,仍舊是失敗
請問還有什麼地方可能有問題嗎?
--
◎龍貓資訊天地(bbs.mgt.ncu.edu.tw)
◎[ashur]From: 140.115.150.165
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: samurai.bbs@bbs.csie.nctu.edu.tw (教教我吧), 看板: Biology
標 題: Re: 請教關於DNA萃取and PCR的問題!
發信站: 交大資工鳳凰城資訊站 (Mon Oct 16 22:46:18 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!feeder.seed.net.tw!ctu-gate!ctu-peer!news.nctu!netnews.cs
※ 引述《ashur.bbs@bbs.mgt.ncu.edu.tw (全世界都可以放棄....)》之銘言：
> sample萃取完tatal DNA之後的電泳很正常(亮度,位置皆正確)
> 可是跑PCR之後就是沒有產物
1.How do you know your PCR target is present in the total DNA pool?
Because 電泳很正常?
2.Check the quality of the PCR primers.
3.Check the purity of your DNA sample.
4.Try to amplify something that DO EXIST in your total DNA sample using
other PCR primers, and see if it works or not...
--
※ Origin: 交大資工鳳凰城資訊站 <bbs.csie.nctu.edu.tw>
◆ From: onion.dorm2.NCTU.edu.tw
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: doe.bbs@bbs.ntu.edu.tw (秋天別來), 看板: Biology
標 題: Re: 請教關於DNA萃取and PCR的問題!
發信站: 台大計中椰林風情站 (Tue Oct 17 02:08:57 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!bbs.ee.ntu!Palmarama
==> ashur.bbs@bbs.mgt.ncu.edu.tw (全世界都可以放棄....) 提到:
> sample萃取完tatal DNA之後的電泳很正常(亮度,位置皆正確)
> 可是跑PCR之後就是沒有產物
> 一開始懷疑是PCR的藥有問題,後來我拿之前做過的sample一起跑
> 結果顯示之前的sample一切正常,就是單單此次的samle失敗
> 為避免雜訊干擾,也已經試過好幾種不同的稀釋倍數,仍舊是失敗
> 請問還有什麼地方可能有問題嗎?
就我做PCR的經驗而言啦
要注意的東西有很多
我不清楚你稀釋倍數是稀釋什麼東西
不過 你所加的MgCl2的濃度 有可能會影響
另外 你的primer的specificity也是重點之一
你的primer的Tm值 和你的PCR的program的溫度設定 也會有相關
通常是annealing temp會比Tm值小個三到五度吧
另外就是你兩端的primer的Tm值相差太多
也有可能會做不出來
再試試看吧 或者去查察一些專門解釋PCR的書
應該都會有幫助的 加油喔 :)
--
☆ [Origin:椰林風情] [From: IP057.dialup.ntu.edu.tw] [Login: **] [Post: 38]
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: reik.bbs@bbs.cs.nthu.edu.tw (...), 看板: Biology
標 題: Re: 請教關於DNA萃取and PCR的問題!
發信站: 清華資訊(楓橋驛站) (Tue Oct 17 17:01:12 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!news.mcu!news.cs.nthu!maple
※ 引述《doe.bbs@bbs.ntu.edu.tw (秋天別來)》之銘言：
> > 可是跑PCR之後就是沒有產物
> > 一開始懷疑是PCR的藥有問題,後來我拿之前做過的sample一起跑
> 應該都會有幫助的 加油喔 :)
請問PCR是... ??
thx~
--
在夕陽西沉
與破曉黎明
短暫交會瞬間... 我徬徨徘徊
--
※ Origin: 楓橋驛站<bbs.cs.nthu.edu.tw> ◆ From: u890410.JEN.ab.nthu.edu.tw
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: twinbee@bbs.ee.ntu.edu.tw (Twinbee), 看板: Biology
標 題: Re: 請教關於DNA萃取and PCR的問題!
發信站: 台大電機 Maxwell BBS (Tue Oct 17 18:01:13 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!bbs.ee.ntu!Maxwell
※ 引述《reik.bbs@bbs.cs.nthu.edu.tw (...)》之銘言：
: ※ 引述《doe.bbs@bbs.ntu.edu.tw (秋天別來)》之銘言：
: > 應該都會有幫助的 加油喔 :)
: 請問PCR是... ??
: thx~
Polymerase chain reaction
^ ^ ^
--
＊ Ｔｗｉｎｂｅｅ ＊
--
※ Origin: 臺大電機 Maxwell 站 ◆ From: ym65020.ym.edu.tw
> -------------------------------------------------------------------------- <
發信人: herman.bbs@cis.nctu.edu.tw (bee), 看板: Biology
標 題: Re: 請教關於DNA萃取and PCR的問題!
發信站: 交大資科_BBS (Wed Oct 18 13:59:23 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!freebsd.ntu!News.Math.NCTU!news.cis.nctu!cis_nctu
==> 在 doe.bbs@bbs.ntu.edu.tw (秋天別來) 的文章中提到:
> ==> ashur.bbs@bbs.mgt.ncu.edu.tw (全世界都可以放棄....) 提到:
> > sample萃取完tatal DNA之後的電泳很正常(亮度,位置皆正確)
> > 可是跑PCR之後就是沒有產物
> > 一開始懷疑是PCR的藥有問題,後來我拿之前做過的sample一起跑
> > 結果顯示之前的sample一切正常,就是單單此次的samle失敗
> > 為避免雜訊干擾,也已經試過好幾種不同的稀釋倍數,仍舊是失敗
> > 請問還有什麼地方可能有問題嗎?
以前的 sample 若是可以的話
這就是一個好的 positive control 顯示你的 PCR system 沒有問題
有問題的地方必定士是在你這一批的 total DNA 上
也就是說你這一批的 total DNA something wrong
可能的原因
1. DNA quality too bad
2. DNA concentration too high
如果是1
把你的 DNA 重新再弄乾淨一點應該問題就可以搞定
若是2
把你的 total DNA 去定量
也把以前可以做的出來的去定量
按照做的出來的當 standard 去 犧士 釋
譬如說 100ug/ul 就可以做出來
你就把你的 total DNA 稀釋到這個濃度再做
如果還有問題再說
> 就我做PCR的經驗而言啦
> 要注意的東西有很多
> 我不清楚你稀釋倍數是稀釋什麼東西
> 不過 你所加的MgCl2的濃度 有可能會影響
> 另外 你的primer的specificity也是重點之一
> 你的primer的Tm值 和你的PCR的program的溫度設定 也會有相關
> 通常是annealing temp會比Tm值小個三到五度吧
> 另外就是你兩端的primer的Tm值相差太多
> 也有可能會做不出來
> 再試試看吧 或者去查察一些專門解釋PCR的書
> 應該都會有幫助的 加油喔 :)
--
* Origin: ★ 交通大學資訊科學系 BBS ★ <bbs.cis.nctu.edu.tw: 140.113.23.3>