在下在準備材料時出了一些問題
想問問有經驗的前輩
我目前用flow cytometry來偵測細胞的DNA content
看看細胞是否發生apoptosis
所使用的染劑是PI
但是在染完PI之後
發現連negative control的細胞都有50%以上的細胞發生apoptosis
也就是處在sub 2n的階段
但是我很確定細胞本身是正常的
我判斷可能是我在處理細胞時不小心把細胞打破了
count時看到的sub 2n其實是細胞的碎片
可是我無法解釋為什麼細胞會破
我固定細胞的方式是用methanol -20度 20分鐘
先前我是用相同的方法固定
大概只有10%的negative control會破
請問這可能是什麼樣的情形造成的
有methanol以外的替代方法嗎?
又
我發現在固定細胞後很容易發生aggregate的現象
我用的是hepG2 cell
請問有什麼解決之道嗎?
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※ Origin: 臺大電機 Maxwell 站 ◆ From: sldoong2.mc.ntu.edu.tw
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發信人: jamboree.bbs@bbs.ntu.edu.tw (休息是待會的事), 看板: Biology
標 題: Re: 請問有關流式細胞儀(flow cytometry)的問題
發信站: 台大計中椰林風情站 (Mon Aug 21 03:58:30 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!bbs.ee.ntu!Palmarama
==> Avatar@bbs.ee.ntu.edu.tw (道德淪喪會會長) 提到:
> 我目前用flow cytometry來偵測細胞的DNA content
> 看看細胞是否發生apoptosis
> 所使用的染劑是PI
> 但是在染完PI之後
> 發現連negative control的細胞都有50%以上的細胞發生apoptosis
> 也就是處在sub 2n的階段
> 但是我很確定細胞本身是正常的
> 我判斷可能是我在處理細胞時不小心把細胞打破了
> count時看到的sub 2n其實是細胞的碎片
> 可是我無法解釋為什麼細胞會破
> 我固定細胞的方式是用methanol -20度 20分鐘
> 先前我是用相同的方法固定
> 大概只有10%的negative control會破
> 請問這可能是什麼樣的情形造成的
> 有methanol以外的替代方法嗎?
我記得current protocal of immunology 裡面有一章有在用FACs測sub G1時
PI solution的配方
太久沒做已經忘記裡面用來fix的成分是什麼了 印象中式沒有methanol
而PI是利用hypotonic solution慢慢滲進細胞的(4C overnight)
另外-20C的處理 雖然methanol本身不結冰（如果沒記錯）
但胞內還是有水分子 freez and thaw結晶有可能會造成破壞吧
> 又
> 我發現在固定細胞後很容易發生aggregate的現象
> 我用的是hepG2 cell
> 請問有什麼解決之道嗎?
上機前pipet 或vortex一下試試看吧
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發信人: hiei.bbs@bbs.csie.nctu.edu.tw (飛影), 看板: Biology
標 題: Re: 請問有關流式細胞儀(flow cytometry)的問題
發信站: 交大資工鳳凰城資訊站 (Mon Aug 21 13:27:12 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!freebsd.ntu!netnews.csie.nctu!bbs
好一陣子沒做了, 我把我的protocol寫給你參考:
1.3000 rpm 5min centrifuge, discard supernatant
2.wash pellet with PBS 2X (Ca,Mg free)
3.resuspend the pellet with 0.2 ml PBS, 這一步要好好打散
4.add 0.2 ml cold abs. alcohol slowly, 並不時mix, 太快加的話會clump.
5.fix at 4度 overnight.
6.第二天add大量PBS dilute alcohol, centrifuge 3000rpm 10min, 不加PBS的話
, 會很難離下來o
7.centrifuge 12,000rpm 1 min
8.discard supernatant, wash with PBS(1% BSA)
9.repeat 6-9 2X
10.接下來就是PI staining & RNase處理了, 不贅述
再來你說sub-G1突然增加很多, 我想會不會是你沒注意threshold, 設太低的話, 就會有
很多雜質出現, sub-G1也會大增o
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發信人: darksaber.bbs@bbs.bot.nchu.edu.tw (好奇心害死貓), 看板: Biology
標 題: Re: 請問有關流式細胞儀(flow cytometry)的問題
發信站: 中興植物後花園 (Mon Aug 21 19:25:39 2000)
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※ 引述《hiei.bbs@bbs.csie.nctu.edu.tw (飛影)》之銘言：
: 好一陣子沒做了, 我把我的protocol寫給你參考:
: 1.3000 rpm 5min centrifuge, discard supernatant
: 2.wash pellet with PBS 2X (Ca,Mg free)
: 3.resuspend the pellet with 0.2 ml PBS, 這一步要好好打散
: 4.add 0.2 ml cold abs. alcohol slowly, 並不時mix, 太快加的話會clump.
: 5.fix at 4度 overnight.
: 6.第二天add大量PBS dilute alcohol, centrifuge 3000rpm 10min, 不加PBS的話
: , 會很難離下來o
: 7.centrifuge 12,000rpm 1 min
: 8.discard supernatant, wash with PBS(1% BSA)
: 9.repeat 6-9 2X
: 10.接下來就是PI staining & RNase處理了, 不贅述
: 再來你說sub-G1突然增加很多, 我想會不會是你沒注意threshold, 設太低的話, 就會有
: 很多雜質出現, sub-G1也會大增o
我是同時看size和DNA content
它們是同時出現sub G1的
光看cell size可能不準,可是看FL2-H的sub G1 peak應該就不會錯了
我懷疑的主要是破碎的cell
因為以我先前用同樣cell上機的經驗
真正的apoptosis發生時
即使FL2-H有很高的sub G1 peak
cell size也不至於全部在sub G1
我現在是想找比較mild的處理方式
不知道有沒有人試過4% paraformaldehyde?
.............快被它搞瘋了
難道是鬼月?.....
非常謝謝你提供的經驗
我會試試看的