問個run gel 的笨問題

[buski (風沙星辰)]

請問一下  在run gel的時候 我們loading的sample
會不會互相污染啊？  因為每次把pipet拿起來時
看到dye散開的樣子 心中就浮現這個問題

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作者: Rhymester (大河文學.com) 看板: Biology
標題: Re: 問個run gel 的笨問題
時間: Tue Aug  8 01:47:39 2000

※ 引述《buski (風沙星辰)》之銘言：
: 請問一下  在run gel的時候 我們loading的sample
: 會不會互相污染啊？  因為每次把pipet拿起來時
: 看到dye散開的樣子 心中就浮現這個問題


  嗯,這個問題很主觀,純粹看你的技術而已,那如果你每次load進去都會跑很多出來,
就算不互相影響,亦會影響到sample的量.不過,照你這樣講,我懷疑是你技術上出了小小
的問題:可能你習慣的把所有sample推進去後,pipet的頭還在buffer裡時,你的拇指
就立即放開,這樣就很容易造成sample散開.總之,小心一點慢慢來啦...


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作者: buski (憶) 看板: Biology
標題: Re: 問個run gel 的笨問題
時間: Tue Aug  8 22:03:36 2000

※ 引述《Rhymester (大河文學.com)》之銘言：
: ※ 引述《buski (風沙星辰)》之銘言：
: : 請問一下  在run gel的時候 我們loading的sample
: : 會不會互相污染啊？  因為每次把pipet拿起來時
: : 看到dye散開的樣子 心中就浮現這個問題
:   嗯,這個問題很主觀,純粹看你的技術而已,那如果你每次load進去都會跑很多出來,
: 就算不互相影響,亦會影響到sample的量.不過,照你這樣講,我懷疑是你技術上出了小小
: 的問題:可能你習慣的把所有sample推進去後,pipet的頭還在buffer裡時,你的拇指
: 就立即放開,這樣就很容易造成sample散開.總之,小心一點慢慢來啦...



   這我倒是有注意啦  沒有那麼嚴重啦  只是覺得疑問而已
   我想是不是DNA product較重不會浮上來  因此不會污染  純粹猜測
   還有一個問題  就是Taq不是耐高溫的酵素嗎？  為什麼不能在室溫下放太久呢？


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作者: Rhymester (大河文學.com) 看板: Biology
標題: Re: 問個run gel 的笨問題
時間: Tue Aug  8 23:06:28 2000

※ 引述《buski (憶)》之銘言：
:    這我倒是有注意啦  沒有那麼嚴重啦  只是覺得疑問而已
:    我想是不是DNA product較重不會浮上來  因此不會污染  純粹猜測
:    還有一個問題  就是Taq不是耐高溫的酵素嗎？  為什麼不能在室溫下放太久呢？


 DNA這麼小,分子量再大也重不了多少吧.

  嗯,這個問題在下不太肯定,不過,個人覺得你這個問題logic上有點不對.
因為不能說它可以耐高溫就等於一定可以放在室溫之下.你還要考慮環境及時間
對它的影響.可能是它放太久會被分解呢....我掰的啦,看看就好~~~


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發信人: [e-mail] (jennifer), 看板: Biology
標  題: Re: 問個run gel 的笨問題
發信站: 台大計中椰林風情站 (Wed Aug  9 07:41:36 2000)
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==> [e-mail] (大河文學.com) 提到:
> ※ 引述《buski (憶)》之銘言：
> :    這我倒是有注意啦  沒有那麼嚴重啦  只是覺得疑問而已
> :    我想是不是DNA product較重不會浮上來  因此不會污染  純粹猜測
> :    還有一個問題  就是Taq不是耐高溫的酵素嗎？  為什麼不能在室溫下放太久呢？
>  DNA這麼小,分子量再大也重不了多少吧.
>   嗯,這個問題在下不太肯定,不過,個人覺得你這個問題logic上有點不對.
> 因為不能說它可以耐高溫就等於一定可以放在室溫之下.你還要考慮環境及時間
> 對它的影響.可能是它放太久會被分解呢....我掰的啦,看看就好~~~


run gel時sample會浮起來可能是你的loading dye不夠重
一般我都是用25% ficoll 400作為10X loading dye,比commerical的配方要好
另外加入orange G這個橘色dye,因為它會跑在最前面,不會干擾你的結果
如果你仍然害怕會浮起來,那就多加一點loading dye

p.s.commerical的loading dye好像大部分都是含有glycerol的6X loading dye


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發信人: [e-mail] (Tip), 看板: Biology
標  題: Re: 問個run gel 的笨問題
發信站: 台大計中椰林風情站 (Wed Aug  9 09:17:40 2000)
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==> [e-mail] (大河文學.com) 提到:
> ※ 引述《buski (憶)》之銘言：
> :    這我倒是有注意啦  沒有那麼嚴重啦  只是覺得疑問而已
> :    我想是不是DNA product較重不會浮上來  因此不會污染  純粹猜測
> :    還有一個問題  就是Taq不是耐高溫的酵素嗎？  為什麼不能在室溫下放太久呢？
>  DNA這麼小,分子量再大也重不了多少吧.
>   嗯,這個問題在下不太肯定,不過,個人覺得你這個問題logic上有點不對.
> 因為不能說它可以耐高溫就等於一定可以放在室溫之下.你還要考慮環境及時間
> 對它的影響.可能是它放太久會被分解呢....我掰的啦,看看就好~~~

Taq DNA polymerase雖然耐高溫，但是時間一久一樣活性會下降，
至於會下降多少依enzyme種類及本身穩定性會有不同。


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發信人: [e-mail], 看板: Biology
標  題: Re: 問個run gel 的笨問題
發信站: 交大生科生命之光 (Wed Aug  9 19:13:58 2000)
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※ 引述 [e-mail] (風沙星辰) 的銘言:
: 請問一下  在run gel的時候 我們loading的sample
: 會不會互相污染啊？  因為每次把pipet拿起來時
: 看到dye散開的樣子 心中就浮現這個問題

那要看你對電泳的目的囉？

如果電泳是為了以分離的方式分析sample，以EtBr+UV成相的話。
通常小小的溢出不會讓你產生可以觀察到的誤差。

但是如果是為了分離與'量'的平行比較，那麼可能在微吸量管的操作上就要很小心。

如果實驗設計中還要把gel裡的sample拿來作比較sensitive的偵測(例如放射造影，
PCR偵測)。那我認為你不只是應該擔心sample浮起來的問題，而是應考慮該不該把
有交互影響的危險性的sample放在一起跑的問題了...

如果你是用水平電泳，我建議你可以試試看先不要讓gel在running buffer中
滅頂，sample加入well之後，用一極稀薄的熔融argarose蓋住well(然後它會封死)，
然後再以running buffer滅頂之。

方法是人想的ㄚ。


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作者: travota (喀摳依桑) 看板: Biology
標題: Re: 問個run gel 的笨問題
時間: Wed Aug  9 20:26:47 2000

※ 引述《Rhymester (大河文學.com)》之銘言：
: ※ 引述《buski (憶)》之銘言：
: :    這我倒是有注意啦  沒有那麼嚴重啦  只是覺得疑問而已
: :    我想是不是DNA product較重不會浮上來  因此不會污染  純粹猜測
: :    還有一個問題  就是Taq不是耐高溫的酵素嗎？  為什麼不能在室溫下放太久呢？
:  DNA這麼小,分子量再大也重不了多少吧.
:   嗯,這個問題在下不太肯定,不過,個人覺得你這個問題logic上有點不對.
: 因為不能說它可以耐高溫就等於一定可以放在室溫之下.你還要考慮環境及時間
: 對它的影響.可能是它放太久會被分解呢....我掰的啦,看看就好~~~

  Taq polymease 也會隨著溫度升高而分解
  只是比起其他酵素算是很耐了
  有一次我把taq的半成品於室溫下放過夜
  結果後來成果還不錯 真險！
  依其商品（promega）說明taq在95度下一小時會失去一半活性
  粉強吧！



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作者: travota (喀摳依桑) 看板: Biology
標題: Re: 問個run gel 的笨問題
時間: Wed Aug  9 20:34:10 2000

※ 引述《[e-mail] (jennifer)》之銘言：
: ==> [e-mail] (大河文學.com) 提到:
: >  DNA這麼小,分子量再大也重不了多少吧.
: >   嗯,這個問題在下不太肯定,不過,個人覺得你這個問題logic上有點不對.
: > 因為不能說它可以耐高溫就等於一定可以放在室溫之下.你還要考慮環境及時間
: > 對它的影響.可能是它放太久會被分解呢....我掰的啦,看看就好~~~
: run gel時sample會浮起來可能是你的loading dye不夠重
: 一般我都是用25% ficoll 400作為10X loading dye,比commerical的配方要好
: 另外加入orange G這個橘色dye,因為它會跑在最前面,不會干擾你的結果
: 如果你仍然害怕會浮起來,那就多加一點loading dye
: p.s.commerical的loading dye好像大部分都是含有glycerol的6X loading dye

  沒錯 sample會飄起主要就是dye放得不足（或是配錯）
  如果再不行 可再換種dye（molecular cloning中有）
  還有在loading時 記得不要把sample的最後一滴擠出
  這樣就可避免sample浮起



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發信人: [e-mail] (老猩猩), 看板: Biology
標  題: Re: 問個run gel 的笨問題
發信站: 奇摩大摩域 (Thu Aug 10 19:46:53 2000)
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※ 引述《[e-mail] (喀摳依桑)》之銘言：
> ※ 引述《[e-mail] (jennifer)》之銘言：
> : run gel時sample會浮起來可能是你的loading dye不夠重
> : 一般我都是用25% ficoll 400作為10X loading dye,比commerical的配方要好
> : 另外加入orange G這個橘色dye,因為它會跑在最前面,不會干擾你的結果
> : 如果你仍然害怕會浮起來,那就多加一點loading dye
> : p.s.commerical的loading dye好像大部分都是含有glycerol的6X loading dye
>   沒錯 sample會飄起主要就是dye放得不足（或是配錯）
>   如果再不行 可再換種dye（molecular cloning中有）
>   還有在loading時 記得不要把sample的最後一滴擠出
>   這樣就可避免sample浮起

我也來補充一下，
如果sample浮的很厲害，就得考慮一下，
是否溶sample的溶質是極性較低，像酒精等等的。
如果有，把它抽氣抽掉就好了。