請問蛋白質電泳~~~~~

想請問跑native蛋白質電泳，也就是說
用來測定分子量的大小，及保留蛋白質的
生物活性，書上好像說用陽離子清潔劑:
cetyltrimethylammonium bromide-PAG

可以告知我詳細的情形嗎?配方之類的~~謝謝!!
--
Ξ Origin: 中興大學天樞資訊網 <[e-mail]> [FROM: 140.120.136.165]

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (教教我吧), 看板: Biology
標  題: Re: 請問蛋白質電泳~~~~~
發信站: 交大資工鳳凰城資訊站 (Thu Aug 24 00:24:24 2000)
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※ 引述《[e-mail] (頭痛的染料(b))》之銘言：
> 想請問跑native蛋白質電泳，也就是說
> 用來測定分子量的大小，及保留蛋白質的
> 生物活性，書上好像說用陽離子清潔劑:
> cetyltrimethylammonium bromide-PAG
> 可以告知我詳細的情形嗎?配方之類的~~謝謝!!

那請問您可不可以說明一下
用native電泳要如何測定蛋白質分子量的大小呀？

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發信人: [e-mail] (single noble), 看板: Biology
標  題: Re: 請問蛋白質電泳~~~~~
發信站: 鴨子寮 (Thu Aug 24 01:54:46 2000)
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※ 引述《[e-mail] (頭痛的染料(b))》之銘言：
> 想請問跑native蛋白質電泳，也就是說
> 用來測定分子量的大小，及保留蛋白質的
> 生物活性，書上好像說用陽離子清潔劑:
> cetyltrimethylammonium bromide-PAG
  ^^^^^
  先說明一下
  有關這一方面的調配方法我是不知道
  不過是不是應該是acetyltrimethylammonium bromide-PAG
                  ^^^^^^
  還是小弟我才疏學淺
  是我搞錯了ㄋ
> 可以告知我詳細的情形嗎?配方之類的~~謝謝!!

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (神秘客), 看板: Biology
標  題: Re: 請問蛋白質電泳~~~~~
發信站: 二中青橄欖 BBS (Thu Aug 24 13:25:39 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!freebsd.ntu!ctu-peer!news.nctu!news.nchu!csc

※ 引述《[e-mail] (教教我吧)》之銘言：
: ※ 引述《[e-mail] (頭痛的染料(b))》之銘言：
: > 想請問跑native蛋白質電泳，也就是說
: > 用來測定分子量的大小，及保留蛋白質的
: > 生物活性，書上好像說用陽離子清潔劑:
: > cetyltrimethylammonium bromide-PAG
: > 可以告知我詳細的情形嗎?配方之類的~~謝謝!!
: 那請問您可不可以說明一下
: 用native電泳要如何測定蛋白質分子量的大小呀？


    跑蛋白質電泳是可以知道蛋白質ㄉ分子量大小ㄉ...
其原理是用比較ㄉ方法....由蛋白質和marker比較......
就可以知道蛋白質ㄉ分子量摟.....
   像我們跑蛋白質電泳....是要將蛋白質煮過在去跑...所以蛋白質只已經denature了..
我們用ㄉ是polyacrylamide的膠....電泳液為SDS buffer...

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (教教我吧), 看板: Biology
標  題: Re: 請問蛋白質電泳~~~~~
發信站: 交大資工鳳凰城資訊站 (Thu Aug 24 16:51:57 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!ctu-gate!news.nctu!netnews.csie.nctu!bbs

※ 引述《[e-mail] (神秘客)》之銘言：
> ※ 引述《[e-mail] (教教我吧)》之銘言：
> : 那請問您可不可以說明一下
> : 用native電泳要如何測定蛋白質分子量的大小呀？
>     跑蛋白質電泳是可以知道蛋白質ㄉ分子量大小ㄉ...
> 其原理是用比較ㄉ方法....由蛋白質和marker比較......
> 就可以知道蛋白質ㄉ分子量摟.....
>    像我們跑蛋白質電泳....是要將蛋白質煮過在去跑...所以蛋白質只已經denature了..
> 我們用ㄉ是polyacrylamide的膠....電泳液為SDS buffer...

鬼扯，您所說的是所謂的SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis(SDS-PAGE)。
跑SDS電泳當然可以用來推論蛋白質的分子量。
我問的是：他說的『ＮＡＴＩＶＥ　ＰＡＧＥ』如何能夠拿來測定蛋白質的分子量！
原作者的問題是要用native PAGE定分子量耶！
又不是問說SDS PAGE如何定分子量！如果是用SDS PAGE，那還有什麼奇巧有趣的？

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (頭痛的染料(b)), 看板: Biology
標  題: Re: 請問蛋白質電泳~~~~~
發信站: 興大天樞資訊網 (Thu Aug 24 18:26:59 2000)
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==> 在 [[e-mail]] 文中提到:
: u!
: ※ 引述《[e-mail] (頭痛的染料(b))》之銘言：
: > 想請問跑native蛋白質電泳，也就是說
: > 用來測定分子量的大小，及保留蛋白質的
: > 生物活性，書上好像說用陽離子清潔劑:
: > cetyltrimethylammonium bromide-PAG
: > 可以告知我詳細的情形嗎?配方之類的~~謝謝!!
: 那請問您可不可以說明一下
: 用native電泳要如何測定蛋白質分子量的大小呀？


如何測，我是不清楚啦!我想跑native是因為我只須要分離，相對蛋白質的大小
，所以這一方面我不清楚，不知道會不會有跑native的marker

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (vivi), 看板: Biology
標  題: Re: 請問蛋白質電泳~~~~~
發信站: 不良牛牧場 (Fri Aug 25 21:44:58 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!bbs.ee.ntu!news.ee.ntu!SimFarm

※ 引述《[e-mail] (教教我吧)》之銘言：
: ※ 引述《[e-mail] (頭痛的染料(b))》之銘言：
: > 如何測，我是不清楚啦!我想跑native是因為我只須要分離，相對蛋白質的大小
: > ，所以這一方面我不清楚，不知道會不會有跑native的marker
: native PAGE當然也可以跑marker啊(why not?)
: 只是就算您拿了marker來跑，在native的情形之下您要如何比較出分子量的大小呢？
: 之所以有『SDS PAGE推定分子量』，是因為SDS PAGE的步驟包括有SDS的處裡。
: 在溶液中帶負電的SDS(sodium dodecyl sulfate)包裹住protein sample，
: 使得sample原本的電性可以不考慮，而單位分子量的帶負電量均等。
: 這樣泳動率與分子大小才會有可以拿來比較的相關性。
: 如您所說，要用native的方式分離，又可以推算出分子量....其實我覺得....
: 如果可以有這樣的電泳方法，我滿希望您可以教教我的....


第一次上這版  覺得蠻有趣的 和大家討論討論
我想  native gel 不應稱 native page
page的意思大家應知道吧
有native  marker  這到沒用過
native gel 是用相對蛋白分子量來判定大小的吧
是可算出大約的分子量大小的

> -------------------------------------------------------------------------- <

作者: biotech (id想好久) 看板: Biology
標題: Re: 請問蛋白質電泳~~~~~
時間: Fri Aug 25 22:05:17 2000

※ 引述《[e-mail] (vivi)》之銘言：
: ※ 引述《[e-mail] (教教我吧)》之銘言：
: : native PAGE當然也可以跑marker啊(why not?)
: : 只是就算您拿了marker來跑，在native的情形之下您要如何比較出分子量的大小呢？
: : 之所以有『SDS PAGE推定分子量』，是因為SDS PAGE的步驟包括有SDS的處裡。
: : 在溶液中帶負電的SDS(sodium dodecyl sulfate)包裹住protein sample，
: : 使得sample原本的電性可以不考慮，而單位分子量的帶負電量均等。
: : 這樣泳動率與分子大小才會有可以拿來比較的相關性。
: : 如您所說，要用native的方式分離，又可以推算出分子量....其實我覺得....
: : 如果可以有這樣的電泳方法，我滿希望您可以教教我的....
: 第一次上這版  覺得蠻有趣的 和大家討論討論
: 我想  native gel 不應稱 native page
: page的意思大家應知道吧
ㄟ  真的不懂說
新手上路  今天恰巧第一次做SDS-page  能夠說是western的簡化版嗎?
原理應該看哪些書籍會獲得較多的資訊?
因為目前大一升大二background實在有待加強
: 有native  marker  這到沒用過
: native gel 是用相對蛋白分子量來判定大小的吧
: 是可算出大約的分子量大小的


> -------------------------------------------------------------------------- <

作者: APOLLO13 (孤獨不寂寞) 看板: Biology
標題: Re: 請問蛋白質電泳~~~~~
時間: Sat Aug 26 11:51:49 2000

※ 引述《[e-mail] (vivi)》之銘言：
: ※ 引述《[e-mail] (教教我吧)》之銘言：
: : native PAGE當然也可以跑marker啊(why not?)
: : 只是就算您拿了marker來跑，在native的情形之下您要如何比較出分子量的大小呢？
: : 之所以有『SDS PAGE推定分子量』，是因為SDS PAGE的步驟包括有SDS的處裡。
: : 在溶液中帶負電的SDS(sodium dodecyl sulfate)包裹住protein sample，
: : 使得sample原本的電性可以不考慮，而單位分子量的帶負電量均等。
: : 這樣泳動率與分子大小才會有可以拿來比較的相關性。
: : 如您所說，要用native的方式分離，又可以推算出分子量....其實我覺得....
: : 如果可以有這樣的電泳方法，我滿希望您可以教教我的....
: 第一次上這版  覺得蠻有趣的 和大家討論討論
: 我想  native gel 不應稱 native page
: page的意思大家應知道吧
: 有native  marker  這到沒用過
: native gel 是用相對蛋白分子量來判定大小的吧
: 是可算出大約的分子量大小的
   關於原作的問題--用native page測分子量大小&活性，
   我想，要測的東西有兩個--1.分子量 2.蛋白質活性，
   關於測定蛋白質活性，一定能測定的應該不多比如oxidase等等，
   若您已知所要測定的蛋白為何，則我想可以用的方法是：
       1. 做一片non-SDS PAGE，即所有配方包括running buffer皆與SDS-PAGE相同，
          但整個system不加SDS。
       2. sample buffer用non-reducing 且no SDS，loading之前也不需煮沸
          （不denature）
       3.loading時加入一standard例如測ATPase，則加入ATPase，至於如何測定ATPase
         的活性，可能要上網找些資料，or問廠商有無此類protocal或kit。
       4.分子量的問題，即直接由ATPase（standard）解決，買來時包裝就會有分子量了

   但是若不知道所要測定的蛋白為何，那上面用standard的方法就沒用了，
   只是若不知所要測的蛋白，那談啥測活性呢？
   因此，若是亟需測定此一蛋白的活性，還是得先知道它屬於哪一類的蛋白質。

   另外，若是此一蛋白為unknown，即無standard可做為control，那麼有個笨方法，
       1.想辦法純化出此一蛋白，通affinity column、HPLC等等。
       2.將此一蛋白用一般SDS-PAGE方法找出分子量。
       3.再另外用non-SDS-PAGE找活性，因為是unknown所以要測哪種活性就隨便玩了。
         可以買不同的substrates測不同enzyme activities。

   最後，要測定蛋白質活性，不一定要跑膠，若知反應物生成物的吸光質，測OD也是種
   方法吧！


> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (教教我吧), 看板: Biology
標  題: Re: 請問蛋白質電泳~~~~~
發信站: 交大資工鳳凰城資訊站 (Sat Aug 26 14:31:21 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!ctu-gate!news.nctu!netnews.csie.nctu!bbs

※ 引述《[e-mail] (vivi)》之銘言：
> 第一次上這版  覺得蠻有趣的 和大家討論討論
> 我想  native gel 不應稱 native page
> page的意思大家應知道吧
> 有native  marker  這到沒用過
> native gel 是用相對蛋白分子量來判定大小的吧
> 是可算出大約的分子量大小的
      ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
錯！
蛋白質在native的狀態於膠體電場中泳動的受力，是與蛋白質的帶電荷有關。
也就是說，不同的蛋白質，即使分子量相同也未必會在native電泳有相同的
泳動速率。所以我在前文中強調，必須要用SDS-PAGE來推定分子量。
SDS-PAGE的denature處理之後，蛋白質的帶電荷正比於分子的大小(因為被
sds的負電分子包附)，單位分子量的電荷可以計為相等。
所以在膠體中，電場有相等的加速度apply在sample上。
基於膠體結構的阻力，分子的泳動率可以呈與分子量反比的關係。
在Native的狀態，並不會有這種相對關係，所以要拿來判斷分子量是鬼扯！
舉一個簡單的例子，就可以知道了：
假設我有一個protein它的pI(等電點)剛好在膠體buffer的pH，那麼它在
Native-PAGE根本不會動，難道您要說它的分子量是很大很大？

還有，為什麼不應稱為native PAGE？
願聞其詳。

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (教教我吧), 看板: Biology
標  題: Re: 請問蛋白質電泳~~~~~
發信站: 交大資工鳳凰城資訊站 (Sat Aug 26 14:37:04 2000)
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※ 引述《[e-mail] (id想好久)》之銘言：
> 新手上路  今天恰巧第一次做SDS-page  能夠說是western的簡化版嗎?

Western Blot 是一種 immuno-detection method.
SDS PAGE 是一種 seperation method.

前者常常是(未必一定要)follow在SDS PAGE之後，後者則未必要作
Western Blot之用。

兩者沒有必然的關係。

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (教教我吧), 看板: Biology
標  題: Re: 請問蛋白質電泳~~~~~
發信站: 交大資工鳳凰城資訊站 (Sat Aug 26 14:49:22 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!ctu-gate!news.nctu!netnews.csie.nctu!bbs

很抱歉原作太長，容我在您的文中發表意見：

※ 引述《[e-mail] (孤獨不寂寞)》之銘言：
>        1. 做一片non-SDS PAGE，即所有配方包括running buffer皆與SDS-PAGE相同，
>           但整個system不加SDS。
>        2. sample buffer用non-reducing 且no SDS，loading之前也不需煮沸
>           （不denature）
>        3.loading時加入一standard例如測ATPase，則加入ATPase，至於如何測定ATPase
>          的活性，可能要上網找些資料，or問廠商有無此類protocal或kit。
>        4.分子量的問題，即直接由ATPase（standard）解決，買來時包裝就會有分子量了
               ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^

終於還是有人把詳細步驟貼出來了。
像您這種跑法，就是所謂native-PAGE了。我想您的意思應該是說，
除非Protein(ATPase)和作marker的(ATPase)完全一樣，否則也比不出來吧？
不過這麼剛好的事您應該也覺得是可遇而不可求吧？

我認為
如果真是要作native的protein分子量測試，
講了這麼多，不如跑個Molecular Sieve(Gel filtration)column算了。

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (貓跟著音符舞著~), 看板: Biology
標  題: Re: 請問蛋白質電泳~~~~~
發信站: 台大計中椰林風情站 (Sat Aug 26 22:45:48 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!bbs.ee.ntu!Palmarama

==> [e-mail] (教教我吧) 提到:
> 很抱歉原作太長，容我在您的文中發表意見：
> ※ 引述《[e-mail] (孤獨不寂寞)》之銘言：
> >        1. 做一片non-SDS PAGE，即所有配方包括running buffer皆與SDS-PAGE相同，
> >           但整個system不加SDS。
> >        2. sample buffer用non-reducing 且no SDS，loading之前也不需煮沸
> >           （不denature）
> >        3.loading時加入一standard例如測ATPase，則加入ATPase，至於如何測定ATPase
> >          的活性，可能要上網找些資料，or問廠商有無此類protocal或kit。
> >        4.分子量的問題，即直接由ATPase（standard）解決，買來時包裝就會有分子量了
>                ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
> 終於還是有人把詳細步驟貼出來了。
> 像您這種跑法，就是所謂native-PAGE了。我想您的意思應該是說，
> 除非Protein(ATPase)和作marker的(ATPase)完全一樣，否則也比不出來吧？
> 不過這麼剛好的事您應該也覺得是可遇而不可求吧？
> 我認為
> 如果真是要作native的protein分子量測試，
> 講了這麼多，不如跑個Molecular Sieve(Gel filtration)column算了。


        ㄜ......看完一整系列的文章，我要講的就是您的最後一句話...

        用gel filtration比較精確。

        不過今天才問過學長，跑Native用marker只能參考用，而且並不那麼準確，
        雖然還是有些特別的marker可以"比較準"的比對，但是還是比SDS or gel
        filtration來的差的多。

        不過做SDS會有個小小的疑問就是跑SDS出來的東西，如果是雜蛋白，那就
        跟本不曉得當初要看的是哪一條band了，尤其是如果本來想看的蛋白不是
        monomer的話...

        所以如果真要精確的知道分子量的話，就去跑column吧~......

        初步分析蛋白質的話，就參考參考marker吧~.....

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (VIER LETZTE LIEDER), 看板: Biology
標  題: Re: 請問蛋白質電泳~~~~~
發信站: 台大計中椰林風情站 (Sun Aug 27 15:54:23 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!bbs.ee.ntu!Palmarama

==> [e-mail] (教教我吧) 提到:
我覺得很有趣的是
他的蛋白量有少到只夠跑一次native gel
又要同時定分子量嗎?
分兩個跑不就好了
> ※ 引述《[e-mail] (vivi)》之銘言：
> > 第一次上這版  覺得蠻有趣的 和大家討論討論
> > 我想  native gel 不應稱 native page
> > page的意思大家應知道吧
> > 有native  marker  這到沒用過
> > native gel 是用相對蛋白分子量來判定大小的吧
> > 是可算出大約的分子量大小的
>       ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
> 錯！
> 蛋白質在native的狀態於膠體電場中泳動的受力，是與蛋白質的帶電荷有關。
> 也就是說，不同的蛋白質，即使分子量相同也未必會在native電泳有相同的
> 泳動速率。所以我在前文中強調，必須要用SDS-PAGE來推定分子量。
> SDS-PAGE的denature處理之後，蛋白質的帶電荷正比於分子的大小(因為被
> sds的負電分子包附)，單位分子量的電荷可以計為相等。
> 所以在膠體中，電場有相等的加速度apply在sample上。
> 基於膠體結構的阻力，分子的泳動率可以呈與分子量反比的關係。
> 在Native的狀態，並不會有這種相對關係，所以要拿來判斷分子量是鬼扯！
> 舉一個簡單的例子，就可以知道了：
> 假設我有一個protein它的pI(等電點)剛好在膠體buffer的pH，那麼它在
> Native-PAGE根本不會動，難道您要說它的分子量是很大很大？
> 還有，為什麼不應稱為native PAGE？
> 願聞其詳。

> -------------------------------------------------------------------------- <

發信人: [e-mail] (夠了真是), 看板: Biology
標  題: Re: 請問蛋白質電泳~~~~~
發信站: 清華生命科學 BBS (Mon Aug 28 17:28:45 2000)
轉信站: Ptt!news.ntu!freebsd.ntu!news.cs.nthu!news.nthu!nthuls

※ 引述《[e-mail] (教教我吧)》之銘言：
> ※ 引述《[e-mail] (頭痛的染料(b))》之銘言：
> > 如何測，我是不清楚啦!我想跑native是因為我只須要分離，相對蛋白質的大小
> > ，所以這一方面我不清楚，不知道會不會有跑native的marker
> 如您所說，要用native的方式分離，又可以推算出分子量....其實我覺得....
> 如果可以有這樣的電泳方法，我滿希望您可以教教我的....

Native gel是可以用來定蛋白質分子量的
但是有些條件限制
詳細資料到圖書館查
找本專門講gel electrophoresis的書就有了

這本書可以參考一下
Gel Electrophoresis of Proteins: A pratical Approach 2nd ed.
Hames, B. D. and Rickwood, D.
IRC Press