推 turtle24:推 05/03 18:03
※ 引述《waitingu (Phil-Ku)》之銘言：
: 這幾天準備犧牲做尾靜脈注射癌細胞，打算看轉移模式的一批小鼠
: 主要取的器官有lung，但看其他paper也有人會順便取lymph node，觀察其大小
: 1.如何計算nodule數量？
: 查了之前實驗室學長姐發表的文獻，裡面都沒有把如何計算metastatic nodule的方法
: 寫得詳細點的protocol
: (例如是取下器官後先數再固定，還是先固定再數；是否需要染色...等等)
: 而自己取了兩次的經驗，固定後組織會呈現白白的，其實看不太出來@@"
: 而且自己界定是否為nodule好像也有點主觀
: 希望有做過這種實驗的版友能不吝分享您的方法，感謝^^
: 2.如何取下小鼠的lymph node
: 查了一些大陸網站，裡面有說用斷頸犧牲的方式會使lymph node充血而不好取
: 但我解剖時根本連lymph node在哪都看不到XD
: 有沒有版友能分享相關的取樣方法呢？
: (之前連結已經失效了)
: 感謝^^
首先感謝vichun版友給予許多協助與建議
由於動物實驗自己還是新手，所以整理了一下這幾次的心得給其他沒做過的板友參考一下
首先，要找到lymph node(後稱LN)
對沒有學長姊指導，或是非生理(解剖)相關實驗室的新手來說，並不容易
(但只要找到一次，之後就很容易上手了)
因此強烈建議皮下注射dye去染色，而paper常看到的是Evans Blue或Chicago sky blue
但一般只做細胞培養的實驗室，通常沒有這兩種dye，因此我參照這篇文獻
http://0rz.com/UFyvNs Table 1可以看到，其實常用來記數細胞的Trypan Blue
與plasma proteins亦非常良好，因此參照另一篇文獻的方法 http://0rz.com/nFzNQd
1.麻醉小鼠之後(方便注射)
配置0.5%(w/v)的Trypan Blue in PBS，以皮下注射打入小鼠的腳趾上腳背及腳後跟
另外也在離肛門約1cm的尾巴兩側皮下注射，各約20uL
(打完會稍微隆起如藍色小水泡，但過一陣子即消去)
2.30分鐘後，以二氧化碳犧牲小鼠
3.以由外而內的解剖方式觀察，即可看到淋巴結如同文獻中述呈現被染色的狀態
(所謂由外而內解剖是指，先幫小鼠蛻皮，此時即可看到淋巴結在血管交會處，
照相觀察後，才打開腹腔，觀察體內的淋巴結以及其他癌細胞可能轉移的器官)
4.計算淋巴結大小，數量，並取樣照相等等
目前此方法可以成功看到小鼠AX, IN, PO等部位的淋巴結
但體內renal或是腸繫膜的LN，可能由於我的實驗設計或是其他因素，沒有明顯的發現
提供一些心得給想要做此實驗的板友，也期待各位的分享指教，謝謝^^
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