Re: [請益]請問如何表達toxic protein在BL21(DE3)ꤠ…

[Ren (wisc)]

※ 引述《[e-mail] (go!go!!go!!!)》之銘言：
: 代po~~還請各位高手幫幫忙<(_ _)>
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: 請問大家有overexpress cytotoxic protein的經驗嗎
: 我要overexpress的toxic protein,42kd
: 在BL21(DE)不太WORK
: 所以換到
: BL(pLysE)strain
: 第一次小量overexpression

先養到1L, (e.g. M9) OD>1.0 (2g α-D-Glucose/Glc)
然後再加IPTG(or 或用來induce的藥品）以及另外2g Glc.(if using
stock solution, then it's 10mL 20% (w/v) Glc)

Let me know, thanks!
: 有明顯的overexpression
: 再來就發現35kd左右的band被overexpressed了!!!
: 42kd的band就不見了
: 請問大家對toxic protein的overexpression有經驗的可以分享一下嗎

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 76.204.102.39

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作者: Ren (wisc) 看板: Biotech
標題: Re: [請益]請問如何表達toxic protein在BL21(DE3)ꤠ…
時間: Thu Aug 16 08:50:13 2007

※ 引述《qumai (._.)》之銘言：
: 借用一下文章
: 剛好也有這樣的問題^^a
: : 先養到1L, (e.g. M9) OD>1.0 (2g α-D-Glucose/Glc)
: 請問是一開始就加入2g α-D-Glucose/Glc
: 然後養到OD>1.0嗎
Yes.

嗯。但實際上在inoculate的過程中，可以測試最大 OD_600nm.
像以正常的 x mL LB->20/50mL M9->1L M9，這個20 or 50mL
就可以大概知道這次的medium and colony可以長到最多多少，
當然這會讓你slightly over-grown，不過基本上看到OD掉了，
就立刻換1L應該影響不大。

以BL21(DE3)pLysS來說，用glycerol stock勉強可以，但仍以
fresh transformation最佳。測試條件如果是表現問題，應該
用最高品質來試比較容易抓到條件。

我在用的M9（網路上有很多版本）
1. Na2HPO4(anhydrous) 67.8g (10x M9)
2. KH2PO4 30g
3. NaCl 5g
4. 調整pH，如果是要用isotope NH4Cl的話，否則可以和NH4Cl一起調到pH7.4
至於5x or 10x都可以，但都會有不等的沈澱，對我的系統來說並不影響結果。
如果你不放心，那就每次都新配→autoclave.
5. Glc=4g (2g+2g), 全部都是先配Glc=2g, 只有最後要加 IPTG才把剩下的2g
   加給菌吃。

過程就是→
xmL LB OD_600nm =0.5~3.0/OD here should be OK (not critical), (spin down)
20/50mL M9 OD_600nm~OD_max (spin down or not for lazy people like me)
1L M9 reaching OD_max
->add more Glc and IPTG at the same time.

這種作法的缺點是：菌一定要耐得了overgrown, 而且菌的品質要好，
再來OD_max不一定是induce的最佳條件。

不過因為表現出來的蛋白可能有毒，所以就以最大菌數來撐蛋白產量，
表現到菌死掉那就無所謂了。

因此，如果你的蛋白要養到>10小時才會出來，那就可能不適合這樣作。

好處…好處就是菌會等你…因為沒東西吃了。熟了之後你也不必管OD的問題…

: : 然後再加IPTG(or 或用來induce的藥品）以及另外2g Glc.(if using
: : stock solution, then it's 10mL 20% (w/v) Glc)
: : Let me know, thanks!
: 我目前嘗試在前面加上signal peptide
: 還是看不到有表現orz
: 而且..BL21(DE3)本身
: 會有兩個蠻粗的band在18.4及25 kDa的地方
: 很容易誤會是overexpression的產物 囧

PAGE? 這技術還是需要有一點時間去找到染色、退染的最好時間和ETOH/MEOH
的比率的，over-destain的話，好不容易表現出來的蛋白就看不到了。

當然染不起來也可能是蛋白本身的問題，那麼就要破掉1L的菌純化才會知道是
不是染不到蛋白的問題了。

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◆ From: 76.204.102.39
※ 編輯: Ren             來自: 76.204.102.39        (08/16 08:52)

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作者: Ren (wisc) 看板: Biotech
標題: Re: [請益]請問如何表達toxic protein在BL21(DE3)ꤠ…
時間: Thu Aug 16 09:58:06 2007


補充一點，如果M9養不好，還是就用LB吧。

方式也差不多，就50%LB開始，最後再加（粉末）LB.，不過一開始的比率其實是很
需要嘗試的。

所以建議還是用rich medium先才對。TB, LB, celtone etc.確定真的有
東西再繼續。否則就不是菌表現的問題。

另外養M9的時候也建議加維他命。
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/SIGMA/B6891
trace metals也建議加(other than MgSO4, CaCl2)。…不過一時間找不到recipe:P

新手的話，記得某關鍵步驟可以換人做做看，搞不好就出來了。
Good luck!

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◆ From: 76.204.102.39
→ Ren:…結論就是，其實這個方式是highly experimental.
→ Ren:不過就我的系統，產量都是一般方法的二倍以上。
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作者: Ren (wisc) 看板: Biotech
標題: Re: [請益]請問如何表達toxic protein在BL21(DE3)ꤠ…
時間: Mon Aug 20 02:08:33 2007

※ 引述《Ren (wisc)》之銘言：
: ※ 引述《qumai (._.)》之銘言：
: : 借用一下文章
: : 剛好也有這樣的問題^^a
: : 請問是一開始就加入2g α-D-Glucose/Glc
: : 然後養到OD>1.0嗎
: Yes.

再補充一下好了，免得說得大家不敢用。

其實一開始還蠻簡單的，就是要refine condition的時候變因會比較多，
最後要fix condition得試比較多條件。

day1:   fresh transformation with SOC recovery for 1 hour. (1700-1830)
        fresh LB plate with specific antibiotics.
        (e.g. BL21(DE3)pLysS with pET system, for Chloramphenicol+AMP)

day2:   (+12~ 14 hours in 37C incubator)→ plate ready (7~9:00AM)
        （Don't use plate trnasfered for more than 3 days.)
        Inoculate 2~5mL LB in the test tube for 6~8hours
        (recommend to use multiple colonies for BL21(DE3)pLysS
        for the first time )
        with shaking ~ 250rpm, 37C (9:00AM to 18:00)→ LB culture ready
        Spin down with <2,000rpm slow speed for several minutes
        (change LB into M9)

day2 O/N into 250mL flask with 20~50mL M9 (Glc2g)
        M9 recipe: M9 salts, NH4Cl, vitamin, Glc 2g, MgSO4, CaCl2
        (1800 to 24:00)→ test OD_600nm for OD_max in 20mL M9,→ M9 ready
        （Spin down or not)（24:00 to tomorrow 10:00AM)→20mL into 1L.

day3    (10:00AM)→ M9 1L ready→ Add IPTG and 10mL 20%Glc. (Glc2g).
        shake another 3~6 even 10 hours. and then harvest.

一開始可以作到nearly no check point.  不過建議你還是在M9的最後階段測一下
OD, 如果你的culture OD<1.5, then your system is much more picky than mine.
我的可以達到3以上。

Good luck!

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◆ From: 76.201.146.194
→ Ren:有問題再問我吧！
推 qumai:真的很感謝您熱心回答 <(_ _)>
推 bioeric:很讚的步驟....感謝....