推 ptt0:plaque不是有就要算嗎@@??140.112.213.127 05/10
推 soulkiss:我之前算plaque明顯比較小很多的就忽略不算 192.192.90.210 05/10
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作者: Resd (遙遠的未來) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問有人在做plaque assay嘛？
時間: Wed May 11 09:23:16 2005
※ 引述《soulkiss (OO)》之銘言：
: 我做的實驗要用篩藥物對病毒是否有影響
: 用plaque assay時發現了一個問題
: 因為我一開始在學plaque assay時是用來測病毒的titer
: 所以數的時候都是數最大的plaque（因為其它小的plaque有可能是由同一個virus造成的ꄊ: 不過在做篩藥實驗時
: 就發現有些藥物除了減少plaque數目外 可能也會使得plaque size縮小
: 所以我再算的時候就會不知道要怎麼算@@
: 感覺誤差好大
: 有沒有人有做這一方面的實驗是要怎麼算
: 才可以算的比較準確><
: 謝謝~
方便請問你詳細的步驟嗎?
我現在也在做plaque assay
可是 都做不出來 :(
實驗室以前沒人做過
我查到的有用neutral red染色 也有用結晶紫染色的
我現在用neutral red去染 不過都沒有結果
不知道是哪個步驟出了問題
--
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◆ From: 61.220.178.27
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發信人: [email protected] (我是麥克林), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 請問有人在做plaque assay嘛？
發信站: 批踢踢參 (Wed May 11 17:21:23 2005)
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※ 引述《[email protected] (遙遠的未來)》之銘言：
: 方便請問你詳細的步驟嗎?
: 我現在也在做plaque assay
: 可是 都做不出來 :(
: 實驗室以前沒人做過
: 我查到的有用neutral red染色 也有用結晶紫染色的
: 我現在用neutral red去染 不過都沒有結果
: 不知道是哪個步驟出了問題
如果不染的話,光用酒精脫水固定之後就可以看到plaque了吧!
不過我之後會再用結晶紫染色會更清楚! :P
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◆ From: 133.11.217.244
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發信人: [email protected] (C'est), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 請問有人在做plaque assay嘛？
發信站: LIFE (Fri May 13 06:25:06 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!LIFE
※ 引述《[email protected] (遙遠的未來)》之銘言：
> 方便請問你詳細的步驟嗎?
> 我現在也在做plaque assay
> 可是 都做不出來 :(
> 實驗室以前沒人做過
> 我查到的有用neutral red染色 也有用結晶紫染色的
> 我現在用neutral red去染 不過都沒有結果
> 不知道是哪個步驟出了問題
我們實驗室也是用結晶紫
你可以把你作plaque assay步驟說出來給大家聽
這樣我們也好提供意見給你
--
┌┼ Origin: 國立中興大學˙中興生科 bbs.life.nchu.edu.tw
└┘ Author: eriel 從 140.116.147.210 發表
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作者: Resd (遙遠的未來) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問有人在做plaque assay嘛？
時間: Thu May 12 23:37:21 2005
※ 引述《[email protected] (C'est)》之銘言：
: ※ 引述《[email protected] (遙遠的未來)》之銘言：
: > 方便請問你詳細的步驟嗎?
: > 我現在也在做plaque assay
: > 可是 都做不出來 :(
: > 實驗室以前沒人做過
: > 我查到的有用neutral red染色 也有用結晶紫染色的
: > 我現在用neutral red去染 不過都沒有結果
: > 不知道是哪個步驟出了問題
: 我們實驗室也是用結晶紫
: 你可以把你作plaque assay步驟說出來給大家聽
: 這樣我們也好提供意見給你
我上次做是fallow我找到的一篇論文
用6 well去做，cell先在6well中養一天，
隔天加入不同倍數的病毒稀釋液，37C感染兩小時之後用PBS wash 三次。
然後加入含1% agarose,1ul/ml trypsin的medium 2ml perwell，
(用2%的agarose跟2倍濃度的medium做1:1稀釋)。然後37度C倒置培養三天。
再加入1% agarose 跟0.1%neutral red 的PBS 0.5ml per well，37C 五小時之後觀察。
(這當中medium 加2ml是我自己試的，因為paper上沒寫該加多少
後面加0.5ml也是）
之後我有問到另一個protocol
不過因為不是很確定這當中的步驟 所以還沒有做
另一個protocol如下：
（以下的步驟不是我寫的，請不要引用，謝謝）
1.病毒以漢克緩衝液 (Hank's solution) 做十倍連續稀釋，由10-1稀釋至10-7。
2.把單層細胞的上清液吸掉後，加上病毒稀釋液0.05 ml，每一稀釋液接種二個洞(well)
並放置在37 ℃溫箱一小時，其間每十五分鐘搖動一次，使病毒可充分與細胞接觸。
3.二倍的Eagles液與二倍高級瓊脂等量混合，即成一倍的工作液，(Eagles 培養液放在
37 ℃水箱半小時) ，此時溫度約為41℃，每一洞內加0.5ml。
4.放37 ℃溫箱培養，並含二氧化碳2.5 %。
5.48～96小時，顯微鏡觀察有CPE時，以10% 福馬林固定液一滴加於一個洞中，過夜。
6.固定後之微量盤置於水龍頭下，以水沖掉瓊脂，倒放，使水份流乾。
7.以1 % 結晶紫染液二滴染色一分鐘，再以自來水沖洗染液，直至無染料洗出為止。
8.自然乾燥後，便顯出無色的不規則空洞。
我看不懂的是5～6的部分
步驟5，10%福馬林加下去之後，agar會溶掉嗎？還是會滲進去？
這時候應該是要放回37度C吧？ 那要倒放還是正放？
步驟6是我最困惑的地方，用水把agar沖掉，cell不會因此跟著被沖掉嗎？
另外就是，這些含有病毒的東西，沖到水槽去會不會怎樣？
請有經驗的人幫我解答一下好嗎？ 謝謝！
這個實驗我實在是從來沒做過，實驗室也沒有其他人在做
一切都是我用想像的然後去試試看
--
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◆ From: 219.91.78.235
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作者: ad1980 (DREAMCHASER) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問有人在做plaque assay嘛？
時間: Fri May 13 13:43:12 2005
※ 引述《Resd (遙遠的未來)》之銘言：
[恕刪]
: 4.放37 ℃溫箱培養，並含二氧化碳2.5 %。
: 5.48～96小時，顯微鏡觀察有CPE時，以10% 福馬林固定液一滴加於一個洞中，過夜。
: 6.固定後之微量盤置於水龍頭下，以水沖掉瓊脂，倒放，使水份流乾。
: 7.以1 % 結晶紫染液二滴染色一分鐘，再以自來水沖洗染液，直至無染料洗出為止。
: 8.自然乾燥後，便顯出無色的不規則空洞。
: 我看不懂的是5～6的部分
: 步驟5，10%福馬林加下去之後，agar會溶掉嗎？還是會滲進去？
福馬林 是 formaldehyde 嘛？
是的話，agar 不會溶，會滲下去 fix cells...
: 這時候應該是要放回37度C吧？ 那要倒放還是正放？
我都放室溫一個小時。正放就ok...
: 步驟6是我最困惑的地方，用水把agar沖掉，cell不會因此跟著被沖掉嗎？
我是用小的 spatular 把 agar 挖下來。
但是要從 dish or well 的邊緣小心的把 agar 翹起來，
免得把細胞一起刮掉，
dish 倒過來後 agar 就會自己掉下來。
之後直接加結晶紫染色約 15-30 分鐘，再用水沖掉。
(agar goes to biohazard waste...)
: 另外就是，這些含有病毒的東西，沖到水槽去會不會怎樣？
: 請有經驗的人幫我解答一下好嗎？ 謝謝！
: 這個實驗我實在是從來沒做過，實驗室也沒有其他人在做
: 一切都是我用想像的然後去試試看
希望有回答到你的問題。
--
絕不做會讓自己後悔的事，
做了就不要後悔。
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◆ From: 154.5.164.136
※ 編輯: ad1980 來自: 154.5.164.136 (05/13 13:44)
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發信人: [email protected] (我是麥克林), 看板: Biotech
標 題: Re: [問題] 請問有人在做plaque assay嘛？
發信站: 批踢踢參 (Fri May 13 15:50:59 2005)
轉信站: ptt!Group.NCTU!grouppost!Group.NCTU!ptt3
※ 引述《[email protected] (遙遠的未來)》之銘言：
: ※ 引述《[email protected] (C'est)》之銘言：
: : 我們實驗室也是用結晶紫
: : 你可以把你作plaque assay步驟說出來給大家聽
: : 這樣我們也好提供意見給你
: 我上次做是fallow我找到的一篇論文
: 用6 well去做，cell先在6well中養一天，
: 隔天加入不同倍數的病毒稀釋液，37C感染兩小時之後用PBS wash 三次。
: 然後加入含1% agarose,1ul/ml trypsin的medium 2ml perwell，
: (用2%的agarose跟2倍濃度的medium做1:1稀釋)。然後37度C倒置培養三天。
: 再加入1% agarose 跟0.1%neutral red 的PBS 0.5ml per well，37C 五小時之後觀察。
: (這當中medium 加2ml是我自己試的，因為paper上沒寫該加多少
: 後面加0.5ml也是）
這個我沒有作過... :P
: 之後我有問到另一個protocol
: 不過因為不是很確定這當中的步驟 所以還沒有做
: 另一個protocol如下：
這比較像我做的~
: （以下的步驟不是我寫的，請不要引用，謝謝）
: 1.病毒以漢克緩衝液 (Hank's solution) 做十倍連續稀釋，由10-1稀釋至10-7。
: 2.把單層細胞的上清液吸掉後，加上病毒稀釋液0.05 ml，每一稀釋液接種二個洞(well)
: 並放置在37 ℃溫箱一小時，其間每十五分鐘搖動一次，使病毒可充分與細胞接觸。
: 3.二倍的Eagles液與二倍高級瓊脂等量混合，即成一倍的工作液，(Eagles 培養液放在
: 37 ℃水箱半小時) ，此時溫度約為41℃，每一洞內加0.5mlꄊ
3.除去病毒稀釋液,加入含 0.5% methyl-cellulose,1%FCS(holding sloution)的培養液,置於37 ℃溫箱
直到觀察到有CPE為止. (methyl-cellulose使溶液變黏稠,新生的virus不容易四處飄
會感染到最初母病毒感染處附近的細胞,所以形成plaque時,會與母病毒的plaque
融合在一起,這樣子,得到的plaque會越來越大,但是數目都只有一個,
也就是當初的母病毒數 = 觀察到的大plaque數,但要小心別放太久,不然各個大plaque
融合在一起就慘了..... XD )
: 4.放37 ℃溫箱培養，並含二氧化碳2.5 %。
: 5.48～96小時，顯微鏡觀察有CPE時，以10% 福馬林固定液一滴加於一個洞中，過夜。
觀察到大plaque但是各個plaque尚未融合時,倒掉黏稠培養液,
加入90%甲醇(0.9ml/well)脫水固定 5-10分 鐘 (此時肉眼可見細胞層逐漸變成白色)
: 7.以1 % 結晶紫染液二滴染色一分鐘，再以自來水沖洗染液，直至無染料洗出為止。
同上
: 8.自然乾燥後，便顯出無色的不規則空洞
: 我看不懂的是5～6的部分
: 步驟5，10%福馬林加下去之後，agar會溶掉嗎？還是會滲進去？
: 這時候應該是要放回37度C吧？ 那要倒放還是正放？
我都是正放
: 步驟6是我最困惑的地方，用水把agar沖掉，cell不會因此跟著被沖掉嗎？
倒去黏稠溶液時,細胞不會被倒掉~ :P
: 另外就是，這些含有病毒的東西，沖到水槽去會不會怎樣？
黏稠溶液或是其他含有virus的溶液,最好收集起來autoclave後再倒掉
不過含甲醇的溶液就可以直接倒掉了!
: 請有經驗的人幫我解答一下好嗎？ 謝謝！
: 這個實驗我實在是從來沒做過，實驗室也沒有其他人在做
^^^^^^^^^^
: 一切都是我用想像的然後去試試看
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
加油~~~!
除了自己想像之外,查書,請教別人都是很好的方式!
這樣子你以後會越來越強喔!! ^O^
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◆ From: 133.11.217.244
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作者: eriel (橘子數) 看板: Biotech
標題: Re: [問題] 請問有人在做plaque assay嘛？
時間: Fri May 13 16:59:55 2005
※ 引述《[email protected] (我是麥克林)》之銘言：
: ※ 引述《[email protected] (遙遠的未來)》之銘言：
: : 我上次做是fallow我找到的一篇論文
: : 用6 well去做，cell先在6well中養一天，
: : 隔天加入不同倍數的病毒稀釋液，37C感染兩小時之後用PBS wash 三次。
^^^^^^^^^^^^^^
強烈建議你省略這個步驟後再試一遍
: : 然後加入含1% agarose,1ul/ml trypsin的medium 2ml perwell，
: : (用2%的agarose跟2倍濃度的medium做1:1稀釋)。然後37度C倒置培養三天。
: : 再加入1% agarose 跟0.1%neutral red 的PBS 0.5ml per well，37C 五小時之後觀察。
: : (這當中medium 加2ml是我自己試的，因為paper上沒寫該加多少
: : 後面加0.5ml也是）
agarose也有人用沒錯,但mikelin的方法比較像我們實驗室用的
使用methyl cellulose並且是正放
: : 5.48～96小時，顯微鏡觀察有CPE時，以10% 福馬林固定液一滴加於一個洞中，過夜。
: 觀察到大plaque但是各個plaque尚未融合時,倒掉黏稠培養液,
: 加入90%甲醇(0.9ml/well)脫水固定 5-10分 鐘 (此時肉眼可見細胞層逐漸變成白色)
我認為不必做這個步驟也可以
培養數天後, 吸乾methyl cellulose直接加1cc/well結晶紫,
一至兩小時後以自來水沖洗
注意別直接沖洗WELL內部!
但是因為病毒種類的不同, 所以培養出漂亮的CPE的時間也不同
大概就是上面說的48-96h, 可以多試試看
: : 7.以1 % 結晶紫染液二滴染色一分鐘，再以自來水沖洗染液，直至無染料洗出為止。
: 同上
: : 8.自然乾燥後，便顯出無色的不規則空洞
: : 我看不懂的是5～6的部分
: : 步驟5，10%福馬林加下去之後，agar會溶掉嗎？還是會滲進去？
: : 這時候應該是要放回37度C吧？ 那要倒放還是正放？
: 我都是正放
: : 步驟6是我最困惑的地方，用水把agar沖掉，cell不會因此跟著被沖掉嗎？
: 倒去黏稠溶液時,細胞不會被倒掉~ :P
: : 另外就是，這些含有病毒的東西，沖到水槽去會不會怎樣？
以紫外線照射一個晚上後加漂白水混勻後倒掉
: 黏稠溶液或是其他含有virus的溶液,最好收集起來autoclave後再倒掉
: 不過含甲醇的溶液就可以直接倒掉了!
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